| Summary: | Το μελάνωμα αναφέρεται στην ανάπτυξη κακοηθών όγκων που προέρχονται από το συνεχή πολλαπλασιασμό καρκινικών μελανοκυττάρων. Αποτελεί έναν από τους πιο θανατηφόρους δερματικούς καρκίνους με υψηλό μεταστατικό δυναμικό και τα τελευταία χρόνια, η συχνότητα εμφάνισής του συνεχώς αυξάνεται. Έχει διαπιστωθεί πως στο 60% περίπου των μελανωμάτων παρουσιάζονται μεταλλαγές στο γονίδιο της κινάσης BRAF με αποτέλεσμα τη συνεχή ενεργοποίηση του καθοδικού μονοπατιού MAPK και την αναπροσαρμογή του μεταγραφικού και μεταφραστικού προγράμματος. Παρότι έχουν αναπτυχθεί πολλές διαφορετικές κλινικές προσεγγίσεις με θετικά πρώιμα αποτελέσματα, όπως η στοχευμένη αναστολή του μεταλλαγμένου BRAF και η ανοσοθεραπεία, μόνο ένα μικρό ποσοστό των ασθενών ανταποκρίνεται μακροχρόνια, με την πλειονότητα να αναπτύσσει ανθεκτικότητα στη θεραπεία. Υπάρχουν ενδείξεις πως τα καρκινικά μελανοκύτταρα διαθέτουν την ικανότητα να προσαρμόζονται σε συνθήκες stress στο μικροπεριβάλλον τους μειώνοντας το μεταβολισμό τους και ασκώντας επιλεκτική μετάφραση των διαφόρων αναγκαίων γονιδίων. Αυτό πιστεύεται πως επιτυγχάνεται μέσω της ρύθμισης της έναρξης της μετάφρασης. Το κύτταρο μπορεί να ξεκινήσει τη μετάφραση συγκεκριμένων γονιδίων επιστρατεύοντας διαφορετικούς συνδυασμούς παραγόντων έναρξης της μετάφρασης (eIFs) ή/και με την αναγνώριση διαφορετικών αλληλουχιών έναρξης της μετάφρασης (uORFs ή IRES) στα μετάγραφά τους. Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν έχουν βρεθεί ικανοί στόχοι που να αποτρέπουν την ανάπτυξη ανθεκτικότητας, υποδηλώνοντας την επιτακτική ανάγκη δημιουργίας ικανών μοντέλων για την εύρεση του μηχανισμού ανθεκτικότητας και των μορίων που συμβάλλουν σε αυτόν. Στην παρούσα διπλωματική έγινε μελέτη σε μοριακό επίπεδο, των πιθανών μηχανισμών που επιστρατεύουν τα ανθεκτικά κύτταρα για να διαφύγουν την επίδραση του αναστολέα BRAFV600E Vemurafenib, τόσο στο επίπεδο της μεταγραφής όσο και στο επίπεδο της μετάφρασης αλλά και τον πιθανό ρόλο που μπορεί να διαδραματίζει ο eIF3 και οι υπομονάδες του στο φαινόμενο αυτό. Για τη δημιουργία ανθεκτικών μοντέλων, χρησιμοποιήθηκαν οι καρκινικές σειρές μελανώματος A375 και Sk-Mel-5, οι οποίες καλλιεργήθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του φαρμάκου και ύστερα πραγματοποιήθηκε επιβεβαίωση της ανθεκτικότητας τους με προσδιορισμό του IC50 και της κατάστασης της φωσφορυλίωσης του BRAF/ERK μονοπατιού. Επόμενα πειράματα σε επίπεδο mRNA και πρωτεϊνών, έδειξαν πως οι δύο ανθεκτικές σειρές ακολουθούν διαφορετικές οδούς για την απόκτηση της ανθεκτικότητας ρυθμίζοντας διακριτά την έκφραση και την ενεργοποίηση σημαντικών παραγόντων έναρξης της μετάφρασης αλλά και των σηματοδοτικών μονοπατιών που την ελέγχουν. Τα ανθεκτικά Α375 (VR – Vemurafenib Resistant) παρουσίασαν μειωμένη έκφραση και ενεργοποίηση παραγόντων που ευνοούν τη μετάφραση από καλύπτρα, όπως είναι τα μέλη του συμπλόκου eIF4F αλλά και σημαντική μείωση της ενεργοποίησης της S6 κινάσης μέσω του mTORC1 μονοπατιού. Παράλληλα παρουσίασαν σε μεταγραφικό επίπεδο, αύξηση των αντι-αποπτωτικών μορίων ενώ πειράματα του μεταφραστικού ρυθμού τους έδειξαν σημαντική μείωση στους ολικούς ρυθμούς της πρωτεϊνοσύνθεσής τους. Αντίθετα, τα μετασταστικά Sk-Mel-5 VR παρουσίασαν υψηλή ενεργοποίηση της mTOR σηματοδότησης και ενεργοποίηση παραγόντων που παραπέμπουν στη μετάφραση από καλύπτρα με ταυτόχρονη μείωση αρκετών αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών και αυξημένους μεταγραφικούς ρυθμούς. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν και από ανάλυση του πολυσωμικού προφίλ των Sk-Mel-5. Τέλος και στις δύο ανθεκτικές σειρές, παρουσιάστηκε διαφορική έκφραση πολλών υπομονάδων του παράγοντα eIF3, και επιτελέστηκε αποσιώπηση μερικών εξ ’αυτών με τη χρήση του συστήματος CRISPR/Cas13, χωρίς ωστόσο να μελετήθηκε στην παρούσα διπλωματική εργασία ο πιθανός ρόλος τους στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας.
|
|---|
