| Περίληψη: | Η ακριβής και συντονισμένη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης ελέγχεται σε πολλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένου του κύκλου ζωής των μορίων mRNA. Η σταθερότητα των μορίων mRNA εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το μήκος της poly(A) ουράς τους, το οποίο με τη σειρά του ρυθμίζεται, μεταξύ άλλων από τη δράση 3’-5’ εξωριβονουκλεασών, γνωστές ως αποαδενυλάσες. Οι αποαδενυλάσες διακρίνονται σε δύο υπεροικογένειες, τις DEDD και EEP, με βάση τα κατάλοιπα στο ενεργό τους κέντρο. Η PNLDC1 αποτελεί το πιο πρόσφατο μέλος των DEDD αποαδενυλασών και έχει αναφερθεί ως η νουκλεάση που συμμετέχει στην επεξεργασία του 3’ άκρου των πρόδρομων μορίων piRNA σε γαμετικά κύτταρα. Το γονίδιο PNLDC1 στον άνθρωπο εδράζεται στο χρωμόσωμα 6 και η έκφρασή του οδηγεί στην παραγωγή δύο διαφορετικών πρωτεϊνικών ισομορφών μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Αντίθετα, το συγκεκριμένο γονίδιο στο ποντίκι εδράζεται στο χρωμόσωμα 17 και κωδικοποιεί μία μόνο ισομορφή. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας έδειξαν ότι η PNLDC1 παρουσιάζει απόλυτη εξειδίκευση ως προς τα πολυαδενυλιωμένα υποστρώματα και εκφράζεται κυρίως σε γαμετικά και εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της PNLDC1 μειώνονται κατά τη διαφοροποίηση και την ανάπτυξη των κυττάρων και σε διαφοροποιημένα κύτταρα, η έκφρασή του παρατηρείται μόνο έπειτα από την επίδραση απομεθυλιωτικών παραγόντων όπως είναι το 5’-AZA-Deoxycitidine. Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός ρύθμισης του γονιδίου της PNLDC1 στο μεταγραφικό επίπεδο πραγματοποιήθηκε in silico ανάλυση της περιοχής του προαγωγέα η οποία προέβλεψε την ύπαρξη CpG νησίδων, θέσεις οι οποίες είναι πιθανό να υπόκεινται σε μεθυλίωση. Ανάλυση pyrosequencing κατά τη διαφοροποίηση mESCs επιβεβαίωσε την αύξηση των επιπέδων μεθυλίωσης του προαγωγέα φανερώνοντας τις ακριβείς θέσεις καθώς και το ποσοστό μεθυλίωσης σε κάθε μία από αυτές ξεχωριστά. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης του γονιδίου της PNLDC1 σε mESCs και αλληλούχηση νέας γενιάς στο μεταγράφωμα αυτών έδειξαν πως η PNLDC1 συμμετέχει στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται τον επαναπρογραμματισμό, την εξέλιξη του κυτταρικού τους κύκλου και τη ρύθμιση της μεταγραφής και της μετάφρασής τους. Έπειτα, προκειμένου να διερευνηθεί η απουσία της PNLDC1 στις φυσιολογικές συνθήκες όπου αυτή εκφράζεται, κατασκευάστηκε σταθερή κυτταρική σειρά mESCs στην οποία πραγματοποιήθηκε απαλοιφή του γονιδίου Pnldc1 χρησιμοποιώντας το σύστημα επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR/Cas9. Πειράματα αλληλούχησης νέας γενιάς πραγματοποιήθηκαν εκ νέου στα κύτταρα αυτά και τα αποτελέσματα συνάδουν με αυτά έπειτα από την αποσιώπηση του συγκεκριμένου γονιδίου. Περαιτέρω μελέτη σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής και RT-qPCR ανάλυσης έδειξε πως η μείωση των επιπέδων έκφρασης της PNLDC1 στα mESCs οδηγεί στην αναστολή του ρυθμού πολλαπλασιασμού προκαλώντας τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου κατά τη μετάβαση από τη φάση S στην G2/M. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην απορρύθμιση τόσο σημαντικών γονιδίων όσο και μη κωδικών μορίων RNA όπως τα Malat1, Rian, Gas5 και Neat1 τα οποία εμπλέκονται στις παραπάνω κυτταρικές λειτουργίες. Επιπρόσθετα, ανάλυση του πολυσωμικού προφίλ έδειξε πως στα κύτταρα αγρίου τύπου απαντάται μεγαλύτερος αριθμός πολυσωμάτων σε σύγκριση με αυτά που στερούνται την PNLDC1 γεγονός που φανερώνει το χαμηλότερο ρυθμό μετάφρασης των τελευταίων. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε έκτοπη έκφραση της PNLDC1 σε κύτταρα HEK293T η οποία οδήγησε σε αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων επαληθεύοντας τα παραπάνω αποτελέσματα. Τέλος, χρησιμοποιώντας τη διαθέσιμη δομή της hPARN πραγματοποιήθηκε προσομοίωση μοριακής δυναμικής του ενεργού κέντρου της PNLDC1 ακολουθούμενη από υψηλής απόδοσης εικονική αξιολόγηση η οποία επέτρεψε την επιλογή χημικών ενώσεων που εν δυνάμει μπορούν να λειτουργήσουν ως μόρια ρυθμιστές έναντι της δράσης των DEDD αποαδενυλασών. Οι ενώσεις κατατάχθηκαν με βάση την ελεύθερη ενέργεια πρόσδεσης και 12 από αυτές επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη εκ των οποίων 5 εμφάνισαν in vitro δραστικότητα. Συγκεκριμένα, 3 από αυτές αναστέλλουν τη δράση και των δύο αποαδενυλασών, μία φαίνεται να αναστέλλει αποκλειστικά την PNLDC1, ενώ μία δρα ως ενεργοποιητής της PARN. Οι ενώσεις αυτές εξετάστηκαν περαιτέρω ως προς την επίδρασή τους στη βιωσιμότητα και τη φυσιολογία των κυττάρων και επακόλουθη αλληλούχηση νέας γενιάς έδειξε πως δύο από αυτές επηρεάζουν γονίδια τα οποία εμπλέκονται σε βασικές βιολογικές λειτουργίες όπως είναι η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, η μεταγωγή σήματος και η απόκριση στο στρες. Συλλογικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αναδεικνύουν τη PNLDC1 ως σημαντικό ρυθμιστή της μεταγραφής, της μετάφρασης και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά πρώιμα στάδια διαφοροποίησης ενώ παράλληλα αποκαλύπτουν την ύπαρξη χημικών ενώσεων οι οποίες μπορούν να αξιοποιηθούν ως ενεργοί ρυθμιστές της δράσης του ενζύμου αυτού.
|
|---|
