Μελέτη του ρόλου της κυκλίνης Ο και της κυκλίνης Α1 στον κυτταρικό κύκλο

• Κύριος συγγραφέας: Χασάπη, Ελένη
• Άλλοι συγγραφείς: Chasapi, Eleni
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2022
• Θέματα: Κυτταρικός κύκλος; Κυκλίνες; Κυκλίνη Ο; Κυκλίνη Α1; Κεντροσωμάτια; Κεντριόλια; Μητρικό κεντριόλιο; Cell cycle; Cyclins; Cyclin O; Cyclin A1; Centrosomes; Centrioles; Mother centriole

Οι κυκλίνες αποτελούν μία οικογένεια πρωτεϊνών που θεωρούνται βασικοί ρυθμιστές τόσο του κυτταρικού κύκλου, καθώς και του κύκλου των κεντροσωματίων. Χαρακτηρίζονται από την παρουσία μίας συντηρημένης περιοχής, η οποία λέγεται “cyclin box” και αποτελεί τη θέση σύνδεσης για τις κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες CDKs (κινάσες σερίνης /θρεονίνης). Κυκλίνες και CDKs σχηματίζουν ετεροδιμερή, με τις πρώτες να ενεργούν ως ρυθμιστικές υπομονάδες του συμπλόκου, ενώ οι δεύτερες ενεργούν ως καταλυτικές. Διαφορετικά σύμπλοκα κυκλινών με CDKs καθορίζουν τη μετάβαση από τη μία φάση του κύκλου στην επόμενη και εμπλέκονται σε διαδικασίες όπως η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, ο διπλασιασμός του γενετικού υλικού και των κεντριολίων, και ο ακριβής διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων στους δύο πόλους της μιτωτικής ατράκτου και τελικά στα θυγατρικά κύτταρα. Η κυκλίνη Ο έχει χαρακτηριστεί για το ρόλο της στη βιογένεση των πολλαπλών κινητών κροσσών. Έλλειψη της κυκλίνης Ο στους μύες καταλήγει σε υδροκεφαλία, συσσώρευση βλέννας στο αναπνευστικό και μειωμένη γονιμότητα. Όσον αφορά τον ρόλο της στον κυτταρικό κύκλο, ελάχιστα είναι γνωστά. Ωστόσο, η κυκλίνη Ο έχει παρατηρηθεί αυξημένη σε διάφορες μορφές καρκίνου. Η κυκλίνη Α1 εκφράζεται στα πολυκροσσωτά κύτταρα (MCCs) και θεωρείται πως συμμετέχει στο μονοπάτι δημιουργίας των πολλαπλών κινητών κροσσών. Όσον αφορά τον ρόλο της στον κυτταρικό κύκλο, τα δεδομένα για την κυκλίνη Α1 είναι περιορισμένα. Στη παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε ο ρόλος των κυκλινών Ο και Α1 στον κυτταρικό κύκλο. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε αρχικά βιοπληροφορική ανάλυση των κυκλινών Ο και Α1, για την εύρεση των λειτουργικών τους περιοχών μέσα στις αμινοξικές τους αλληλουχίες. Βρέθηκαν λοιπόν, σήματα εισόδου και εξόδου από το πυρήνα, καθώς και αλληλουχίες-σήματα καταστροφής και για τις δύο κυκλίνες, ενώ αλληλουχία εντοπισμού στα κεντροσωμάτια βρέθηκε μόνο για την κυκλίνη Α1. Πειράματα ανοσοφθορισμού, για τη μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού της ενδογενούς κυκλίνης Ο, σε αθανατοποιημένα μη καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα του αμφιβληστροειδούς hTERT-RPE1, σε καρκινικά κύτταρα τραχήλου της μήτρας HeLa και σε αθανατοποιημένα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα HEK 293T, έδειξαν πως πιθανά η κυκλίνη Ο εμφανίζει πυρηνικό εντοπισμό και δεν υπάρχει στα κεντροσωμάτια. Ωστόσο, όταν έγινε αποσιώπηση του γονιδίου της κυκλίνης Ο σε HeLa κύτταρα, ώστε να διαπιστωθεί αν το αντίσωμα πράγματι αναγνωρίζει την πρωτεΐνη, παρά την 85% μείωση που παρατηρήθηκε σε μεταγραφικό επίπεδο, το αντίσωμα έδινε σήμα σε όλα τα κύτταρα, γεγονός που δείχνει πως είναι μη ειδικό αντίσωμα και άρα δε μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον υποκυτταρικό εντοπισμό της κυκλίνης Ο. Πειράματα υπερέκφρασης πλασμιδίου που φέρει το γονίδιο της κυκλίνης Ο σε HeLa κύτταρα, δεν προκάλεσαν σημαντική αλλαγή στους δείκτες του κυτταρικού κύκλου Cdt1 και Geminin, ενώ παρατηρήθηκε πως η κυκλίνη Ο μετά από την υπερέκφραση εντοπίζεται και στον πυρήνα αλλά και στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Πειράματα ποσοτικής real time PCR, έδειξαν πως η κυκλίνη Α1 εκφράζεται στα hTERT-RPE1 κύτταρα και τα επίπεδα mRNA της κυκλίνης Α1 μειώνονται περίπου 60% στα κύτταρα εκτός κύκλου σε σχέση με τα κύτταρα που είναι σε κύκλο. Η μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού της κυκλίνης Α1, με πειράματα ανοσοφθορισμού σε hTERT-RPE1 κύτταρα, κατέδειξε πιθανό πυρηνικό εντοπισμό της κυκλίνης στα κύτταρα. Επίσης, για την κυκλίνη Α1 διεξήχθησαν πειράματα ανοσοφθορισμού με δείκτες για τα κεντροσωμάτια. Με χρώση για τον δείκτη Centrin, βρέθηκε πως η κυκλίνη Α1 εντοπίζεται σε ένα εκ των δύο κεντριολίων που συγκροτούν το κεντροσωμάτιο, ενώ με χρήση του δείκτη Cep164, διαπιστώθηκε πως πρόκειται για το μητρικό κεντριόλιο και συγκεκριμένα τις απομακρυσμένες αποφύσεις αυτού. Η χρώση διατηρείται κατά τη μεσόφαση έως και την πρόφαση, ενώ φαίνεται να χάνεται στα υπόλοιπα μιτωτικά στάδια. Τα αποτελέσματα αυτά εγείρουν το ενδιαφέρουν για περαιτέρω διερεύνηση της κυκλίνης Α1, ώστε να διελευκανθεί το κυτταρικό προφίλ της κυκλίνης και ο λειτουργικός της ρόλος στα κεντροσωμάτια. Όσον αφορά την κυκλίνη Ο θα μπορούσε να διερευνηθεί εκ νέου ο υποκυτταρικός εντοπισμός της με χρήση ειδικού αντισώματος.