| Περίληψη: | Τα Τ λεμφοκύτταρα είναι κύτταρα της προσαρμοστικής ανοσίας με σημαντικές λειτουργίες όπως η παραγωγή κυτταροκινών, η κυτταροτοξικότητα και ο έλεγχος των ανοσοαποκρίσεων. Η ενεργοποίηση ειδικά των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων απαιτεί, ανάμεσα σε άλλα, την μεταγραφή της κυτταροκίνης IL-2 που δρα σαν αυτοκρινής παράγοντας πολλαπλασιασμού για αυτά. Τα Τ βοηθητικά είναι επίσης και στόχος του ιού HIV-1 που ευθύνεται για το σύνδρομο επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS). Μετά την ενσωμάτωση του HIV-1 στο γονιδίωμα των Τ βοηθητικών, η ρύθμιση της μεταγραφής του εξαρτάται από πολλούς ενδογενείς μεταγραφικούς παράγοντες του ξενιστή που προσδένονται στην 5’LTR περιοχή του καθώς και από την έμμεση πρόσδεση σε αυτήν του ιικού ενεργοποιητή Τat. Μεταγραφικοί παράγοντες όπως για παράδειγμα ο NFkB, ο AP-1 και ο NFAT που παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής της IL-2 μέσω της πρόσδεσης τους στον υποκινητή του γονιδίου της, προσδένονται και στη LTR περιοχή του ιού. Η έναρξη της μεταγραφικής δραστηριότητας του ιού που έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή ιικών σωματιδίων, σχετίζεται με την φυσιολογική ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων από κάποιο αντιγόνο ή κυτταροκίνη. Από όλα τα παραπάνω είναι λογικό να υποθέσουμε ότι ο ιός και η IL-2 υπόκεινται σε κοινή μεταγραφική ρύθμιση.
Ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2 είναι μέλος της οικογένειας των ETS μεταγραφικών παραγόντων, που ρυθμίζουν την έκφραση μιας σειράς γονιδίων, μετά από πρόσδεση τους στο DNA μέσω μιας συντηρημένη cis περιοχής που είναι πλούσια σε πουρίνες (GGAA/T). Πειράματα του εργαστηρίου μας έχουν δείξει ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2, δρα τόσο ως μεταγραφικός καταστολέας του HIV-1, μέσω της πρόσδεσης του στην 5’-LTR περιοχή του ιού όσο και ως προ-επαγωγικός μεταγραφικός καταστολέας της έκφρασης της IL-2 στα παρθένα Τ βοηθητικά κύτταρα μέσω της πρόσδεσης του στον υποκινητή της. Όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται η έκφραση του Ets-2 μειώνεται ενώ τόσο η μεταγραφή της IL-2 όσο και αυτή του HIV-1 αυξάνονται.
Ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης της HIV-1 λοίμωξης στη μεταγραφική ρύθμιση του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα. Πιο συγκεκριμένα θέλουμε να μελετήσουμε το εάν και πως επηρεάζει η ενεργοποίηση του ιού την έκφραση του καταστολέα Ets-2 ώστε τελικά να πετύχει την μεταγραφή του γονιδιώματος του.
Για το λόγο αυτό συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης του Ets-2 mRNA ανάμεσα σε κύτταρα Jurkat και J-Lat που καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία μιτογόνων. Τα κύτταρα Jurkat προσομοιάζουν των Τ παρθένων βοηθητικών λεμφοκυττάρων, ενώ τα κύτταρα της J-Lat κυτταρικής σειράς φέρουν στο γονιδίωμα τους μια ανενεργή μολυσματικά εκδοχή του HIV-1 γονιδιώματος (ιικές δεξαμενές). Βρέθηκε ότι η έκφραση του Ets-2 mRNA στα κύτταρα J-Lat είναι μεγαλύτερη από αυτή στα κύτταρα Jurkat, ενώ η επαγόμενη έκφραση της IL-2 στα J-Lat υπολείπεται αυτής στα Jurkat.
Για να ελέγξουμε εάν οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση του Ets-2 mRNA οφείλονται στην ιική πρωτεΐνη Tat, πραγματοποιήσαμε πειράματα υπερέκφρασης της, στην κυτταρική σειρά Jurkat και Jurkat-LTRG. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία μιτογόνων και τους προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις του πλασμιδίου (pcDNA3-tat). Για να εξακριβωθεί η υπερέκφραση σε μεταγραφικό επίπεδο και η έκφραση άλλων γονιδίων, έγινε απομόνωση RNA, παρασκευή cDNA και PCR για να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης. Στα πειράματα διαμόλυνσης στην κυτταρική σειρά Jurkat και στις δυο συνθήκες καλλιέργειας βρέθηκε ότι αυξάνεται η έκφραση του Ets-2 mRNA. Στα πειράματα διαμόλυνσης στην κυτταρική σειρά Jurkat-LTRG στη συνθήκη απουσίας μιτογόνων βρέθηκε ότι η αυξάνεται η έκφραση του Ets-2 mRNA, ενώ στη συνθήκη παρουσία μιτογόνων η έκφραση του Ets-2 mRNA παραμένει σταθερή.
Συμπερασματικά, παρατηρούμε ότι ο ιός HIV-1 ασκεί θετική ρύθμιση στην έκφραση του Ets-2 mRNA μέσο της ιικής πρωτεΐνης Tat σε μη ενεργοποιημένες Τ κυτταρικές σειρές. Βέβαια απαιτούνται περαιτέρω πειράματα σε επίπεδο πρωτεϊνικής έκφρασης και σε πρωτογενή Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα για να εξακριβωθούν τα παραπάνω αποτελέσματα. Ωστόσο, τα αποτελέσματα αυτά θέτουν τις βάσεις για νέα πειράματα τα οποία θα διαλευκάνουν τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους η ιική πρωτεΐνη Tat ρυθμίζει την έκφρασης του μεταγραφικού καταστολέα Ets-2 και τη βιολογική σημασία του μηχανισμού αυτού για το ιό HIV-1.
|
|---|
