Η επίδραση της HIV-1 λοίμωξης στη ρύθμιση της έκφρασης του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα
Τα Τ λεμφοκύτταρα είναι κύτταρα της προσαρμοστικής ανοσίας με σημαντικές λειτουργίες όπως η παραγωγή κυτταροκινών, η κυτταροτοξικότητα και ο έλεγχος των ανοσοαποκρίσεων. Η ενεργοποίηση ειδικά των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων απαιτεί, ανάμεσα σε άλλα, την μεταγραφή της κυτταροκίνης IL-2 που δρα σαν αυτ...
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Language: | Greek |
| Published: |
2022
|
| Subjects: | |
| Online Access: | http://hdl.handle.net/10889/16064 |
| id |
nemertes-10889-16064 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Μεταγραφικός καταστολέας Ets-2 HIV-1 λοίμωξη Ιική πρωτεΐνη Tat Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα Τranscriptional repressor Ets-2 HIV-1 infection Viral protein Tat T helper lymphocytes |
| spellingShingle |
Μεταγραφικός καταστολέας Ets-2 HIV-1 λοίμωξη Ιική πρωτεΐνη Tat Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα Τranscriptional repressor Ets-2 HIV-1 infection Viral protein Tat T helper lymphocytes Σαλίαϊ, Κώστα Η επίδραση της HIV-1 λοίμωξης στη ρύθμιση της έκφρασης του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα |
| description |
Τα Τ λεμφοκύτταρα είναι κύτταρα της προσαρμοστικής ανοσίας με σημαντικές λειτουργίες όπως η παραγωγή κυτταροκινών, η κυτταροτοξικότητα και ο έλεγχος των ανοσοαποκρίσεων. Η ενεργοποίηση ειδικά των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων απαιτεί, ανάμεσα σε άλλα, την μεταγραφή της κυτταροκίνης IL-2 που δρα σαν αυτοκρινής παράγοντας πολλαπλασιασμού για αυτά. Τα Τ βοηθητικά είναι επίσης και στόχος του ιού HIV-1 που ευθύνεται για το σύνδρομο επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS). Μετά την ενσωμάτωση του HIV-1 στο γονιδίωμα των Τ βοηθητικών, η ρύθμιση της μεταγραφής του εξαρτάται από πολλούς ενδογενείς μεταγραφικούς παράγοντες του ξενιστή που προσδένονται στην 5’LTR περιοχή του καθώς και από την έμμεση πρόσδεση σε αυτήν του ιικού ενεργοποιητή Τat. Μεταγραφικοί παράγοντες όπως για παράδειγμα ο NFkB, ο AP-1 και ο NFAT που παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής της IL-2 μέσω της πρόσδεσης τους στον υποκινητή του γονιδίου της, προσδένονται και στη LTR περιοχή του ιού. Η έναρξη της μεταγραφικής δραστηριότητας του ιού που έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή ιικών σωματιδίων, σχετίζεται με την φυσιολογική ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων από κάποιο αντιγόνο ή κυτταροκίνη. Από όλα τα παραπάνω είναι λογικό να υποθέσουμε ότι ο ιός και η IL-2 υπόκεινται σε κοινή μεταγραφική ρύθμιση.
Ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2 είναι μέλος της οικογένειας των ETS μεταγραφικών παραγόντων, που ρυθμίζουν την έκφραση μιας σειράς γονιδίων, μετά από πρόσδεση τους στο DNA μέσω μιας συντηρημένη cis περιοχής που είναι πλούσια σε πουρίνες (GGAA/T). Πειράματα του εργαστηρίου μας έχουν δείξει ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2, δρα τόσο ως μεταγραφικός καταστολέας του HIV-1, μέσω της πρόσδεσης του στην 5’-LTR περιοχή του ιού όσο και ως προ-επαγωγικός μεταγραφικός καταστολέας της έκφρασης της IL-2 στα παρθένα Τ βοηθητικά κύτταρα μέσω της πρόσδεσης του στον υποκινητή της. Όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται η έκφραση του Ets-2 μειώνεται ενώ τόσο η μεταγραφή της IL-2 όσο και αυτή του HIV-1 αυξάνονται.
Ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης της HIV-1 λοίμωξης στη μεταγραφική ρύθμιση του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα. Πιο συγκεκριμένα θέλουμε να μελετήσουμε το εάν και πως επηρεάζει η ενεργοποίηση του ιού την έκφραση του καταστολέα Ets-2 ώστε τελικά να πετύχει την μεταγραφή του γονιδιώματος του.
Για το λόγο αυτό συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης του Ets-2 mRNA ανάμεσα σε κύτταρα Jurkat και J-Lat που καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία μιτογόνων. Τα κύτταρα Jurkat προσομοιάζουν των Τ παρθένων βοηθητικών λεμφοκυττάρων, ενώ τα κύτταρα της J-Lat κυτταρικής σειράς φέρουν στο γονιδίωμα τους μια ανενεργή μολυσματικά εκδοχή του HIV-1 γονιδιώματος (ιικές δεξαμενές). Βρέθηκε ότι η έκφραση του Ets-2 mRNA στα κύτταρα J-Lat είναι μεγαλύτερη από αυτή στα κύτταρα Jurkat, ενώ η επαγόμενη έκφραση της IL-2 στα J-Lat υπολείπεται αυτής στα Jurkat.
Για να ελέγξουμε εάν οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση του Ets-2 mRNA οφείλονται στην ιική πρωτεΐνη Tat, πραγματοποιήσαμε πειράματα υπερέκφρασης της, στην κυτταρική σειρά Jurkat και Jurkat-LTRG. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία μιτογόνων και τους προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις του πλασμιδίου (pcDNA3-tat). Για να εξακριβωθεί η υπερέκφραση σε μεταγραφικό επίπεδο και η έκφραση άλλων γονιδίων, έγινε απομόνωση RNA, παρασκευή cDNA και PCR για να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης. Στα πειράματα διαμόλυνσης στην κυτταρική σειρά Jurkat και στις δυο συνθήκες καλλιέργειας βρέθηκε ότι αυξάνεται η έκφραση του Ets-2 mRNA. Στα πειράματα διαμόλυνσης στην κυτταρική σειρά Jurkat-LTRG στη συνθήκη απουσίας μιτογόνων βρέθηκε ότι η αυξάνεται η έκφραση του Ets-2 mRNA, ενώ στη συνθήκη παρουσία μιτογόνων η έκφραση του Ets-2 mRNA παραμένει σταθερή.
Συμπερασματικά, παρατηρούμε ότι ο ιός HIV-1 ασκεί θετική ρύθμιση στην έκφραση του Ets-2 mRNA μέσο της ιικής πρωτεΐνης Tat σε μη ενεργοποιημένες Τ κυτταρικές σειρές. Βέβαια απαιτούνται περαιτέρω πειράματα σε επίπεδο πρωτεϊνικής έκφρασης και σε πρωτογενή Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα για να εξακριβωθούν τα παραπάνω αποτελέσματα. Ωστόσο, τα αποτελέσματα αυτά θέτουν τις βάσεις για νέα πειράματα τα οποία θα διαλευκάνουν τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους η ιική πρωτεΐνη Tat ρυθμίζει την έκφρασης του μεταγραφικού καταστολέα Ets-2 και τη βιολογική σημασία του μηχανισμού αυτού για το ιό HIV-1. |
| author2 |
Saliai, Kosta |
| author_facet |
Saliai, Kosta Σαλίαϊ, Κώστα |
| author |
Σαλίαϊ, Κώστα |
| author_sort |
Σαλίαϊ, Κώστα |
| title |
Η επίδραση της HIV-1 λοίμωξης στη ρύθμιση της έκφρασης του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα |
| title_short |
Η επίδραση της HIV-1 λοίμωξης στη ρύθμιση της έκφρασης του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα |
| title_full |
Η επίδραση της HIV-1 λοίμωξης στη ρύθμιση της έκφρασης του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα |
| title_fullStr |
Η επίδραση της HIV-1 λοίμωξης στη ρύθμιση της έκφρασης του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα |
| title_full_unstemmed |
Η επίδραση της HIV-1 λοίμωξης στη ρύθμιση της έκφρασης του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα |
| title_sort |
η επίδραση της hiv-1 λοίμωξης στη ρύθμιση της έκφρασης του ets-2 μεταγραφικού καταστολέα |
| publishDate |
2022 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/16064 |
| work_keys_str_mv |
AT saliaïkōsta ēepidrasētēshiv1loimōxēsstērythmisētēsekphrasēstouets2metagraphikoukatastolea AT saliaïkōsta theeffectofhiv1infectionontheregulationofets2transcriptionalrepressorexpression |
| _version_ |
1799945002191683584 |
| spelling |
nemertes-10889-160642022-09-06T05:14:29Z Η επίδραση της HIV-1 λοίμωξης στη ρύθμιση της έκφρασης του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα The effect of HIV-1 infection on the regulation of Ets-2 transcriptional repressor expression Σαλίαϊ, Κώστα Saliai, Kosta Μεταγραφικός καταστολέας Ets-2 HIV-1 λοίμωξη Ιική πρωτεΐνη Tat Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα Τranscriptional repressor Ets-2 HIV-1 infection Viral protein Tat T helper lymphocytes Τα Τ λεμφοκύτταρα είναι κύτταρα της προσαρμοστικής ανοσίας με σημαντικές λειτουργίες όπως η παραγωγή κυτταροκινών, η κυτταροτοξικότητα και ο έλεγχος των ανοσοαποκρίσεων. Η ενεργοποίηση ειδικά των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων απαιτεί, ανάμεσα σε άλλα, την μεταγραφή της κυτταροκίνης IL-2 που δρα σαν αυτοκρινής παράγοντας πολλαπλασιασμού για αυτά. Τα Τ βοηθητικά είναι επίσης και στόχος του ιού HIV-1 που ευθύνεται για το σύνδρομο επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS). Μετά την ενσωμάτωση του HIV-1 στο γονιδίωμα των Τ βοηθητικών, η ρύθμιση της μεταγραφής του εξαρτάται από πολλούς ενδογενείς μεταγραφικούς παράγοντες του ξενιστή που προσδένονται στην 5’LTR περιοχή του καθώς και από την έμμεση πρόσδεση σε αυτήν του ιικού ενεργοποιητή Τat. Μεταγραφικοί παράγοντες όπως για παράδειγμα ο NFkB, ο AP-1 και ο NFAT που παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής της IL-2 μέσω της πρόσδεσης τους στον υποκινητή του γονιδίου της, προσδένονται και στη LTR περιοχή του ιού. Η έναρξη της μεταγραφικής δραστηριότητας του ιού που έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή ιικών σωματιδίων, σχετίζεται με την φυσιολογική ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων από κάποιο αντιγόνο ή κυτταροκίνη. Από όλα τα παραπάνω είναι λογικό να υποθέσουμε ότι ο ιός και η IL-2 υπόκεινται σε κοινή μεταγραφική ρύθμιση. Ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2 είναι μέλος της οικογένειας των ETS μεταγραφικών παραγόντων, που ρυθμίζουν την έκφραση μιας σειράς γονιδίων, μετά από πρόσδεση τους στο DNA μέσω μιας συντηρημένη cis περιοχής που είναι πλούσια σε πουρίνες (GGAA/T). Πειράματα του εργαστηρίου μας έχουν δείξει ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Ets-2, δρα τόσο ως μεταγραφικός καταστολέας του HIV-1, μέσω της πρόσδεσης του στην 5’-LTR περιοχή του ιού όσο και ως προ-επαγωγικός μεταγραφικός καταστολέας της έκφρασης της IL-2 στα παρθένα Τ βοηθητικά κύτταρα μέσω της πρόσδεσης του στον υποκινητή της. Όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται η έκφραση του Ets-2 μειώνεται ενώ τόσο η μεταγραφή της IL-2 όσο και αυτή του HIV-1 αυξάνονται. Ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης της HIV-1 λοίμωξης στη μεταγραφική ρύθμιση του Ets-2 μεταγραφικού καταστολέα. Πιο συγκεκριμένα θέλουμε να μελετήσουμε το εάν και πως επηρεάζει η ενεργοποίηση του ιού την έκφραση του καταστολέα Ets-2 ώστε τελικά να πετύχει την μεταγραφή του γονιδιώματος του. Για το λόγο αυτό συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης του Ets-2 mRNA ανάμεσα σε κύτταρα Jurkat και J-Lat που καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία μιτογόνων. Τα κύτταρα Jurkat προσομοιάζουν των Τ παρθένων βοηθητικών λεμφοκυττάρων, ενώ τα κύτταρα της J-Lat κυτταρικής σειράς φέρουν στο γονιδίωμα τους μια ανενεργή μολυσματικά εκδοχή του HIV-1 γονιδιώματος (ιικές δεξαμενές). Βρέθηκε ότι η έκφραση του Ets-2 mRNA στα κύτταρα J-Lat είναι μεγαλύτερη από αυτή στα κύτταρα Jurkat, ενώ η επαγόμενη έκφραση της IL-2 στα J-Lat υπολείπεται αυτής στα Jurkat. Για να ελέγξουμε εάν οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση του Ets-2 mRNA οφείλονται στην ιική πρωτεΐνη Tat, πραγματοποιήσαμε πειράματα υπερέκφρασης της, στην κυτταρική σειρά Jurkat και Jurkat-LTRG. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία μιτογόνων και τους προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις του πλασμιδίου (pcDNA3-tat). Για να εξακριβωθεί η υπερέκφραση σε μεταγραφικό επίπεδο και η έκφραση άλλων γονιδίων, έγινε απομόνωση RNA, παρασκευή cDNA και PCR για να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης. Στα πειράματα διαμόλυνσης στην κυτταρική σειρά Jurkat και στις δυο συνθήκες καλλιέργειας βρέθηκε ότι αυξάνεται η έκφραση του Ets-2 mRNA. Στα πειράματα διαμόλυνσης στην κυτταρική σειρά Jurkat-LTRG στη συνθήκη απουσίας μιτογόνων βρέθηκε ότι η αυξάνεται η έκφραση του Ets-2 mRNA, ενώ στη συνθήκη παρουσία μιτογόνων η έκφραση του Ets-2 mRNA παραμένει σταθερή. Συμπερασματικά, παρατηρούμε ότι ο ιός HIV-1 ασκεί θετική ρύθμιση στην έκφραση του Ets-2 mRNA μέσο της ιικής πρωτεΐνης Tat σε μη ενεργοποιημένες Τ κυτταρικές σειρές. Βέβαια απαιτούνται περαιτέρω πειράματα σε επίπεδο πρωτεϊνικής έκφρασης και σε πρωτογενή Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα για να εξακριβωθούν τα παραπάνω αποτελέσματα. Ωστόσο, τα αποτελέσματα αυτά θέτουν τις βάσεις για νέα πειράματα τα οποία θα διαλευκάνουν τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους η ιική πρωτεΐνη Tat ρυθμίζει την έκφρασης του μεταγραφικού καταστολέα Ets-2 και τη βιολογική σημασία του μηχανισμού αυτού για το ιό HIV-1. T lymphocytes are cells of adaptive immunity with important functions such as cytokine production, cytotoxicity and control of immune responses. The activation of the T helper lymphocytes requires, among other things, the transcription of the cytokine IL-2, which acts as an autocrine factor for their proliferation. Also, T helper cells are the target of the HIV-1 virus, which is responsible for Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). Following the integration of HIV-1 into the T helper genome, the regulation of its transcription depends on many endogenous host transcription factors that bind to its 5'LTR region as well as the indirect binding to that of the viral activator Tat. Transcription factors such as NFkB, AP-1, and NFAT, both playing a part in regulating IL-2 transcription by binding to its gene promoter, also bind to the LTR region of the virus. The initiation of the transcriptional activity of the virus, which results in the production of viral particles, is related to the normal activation of T lymphocytes by an antigen or cytokine. From all the above it is reasonable to assume that the virus and IL-2 are subjected to common transcriptional regulation. The Ets-2 transcription factor is a member of the ETS transcription factor family, which regulates the expression of a number of genes after they bind to DNA through a purine-rich cis-conserved region (GGAA /T). Our laboratory experiments have shown that the transcription factor Ets-2 acts both as a transcriptional repressor of HIV-1, through its binding to the 5'-LTR region of the virus, and as a pre-inductive transcriptional repressor of IL-2 expression in naive T helper cells through binding to its promoter. When cells are activated, the expression of Ets-2 decreases while both IL-2 and HIV-1 transcription increases. The purpose of this thesis is to study the effect of HIV-1 infection on the transcriptional regulation of the Ets-2 transcriptional repressor. More specifically, we want to study whether and how the activation of the virus affects the expression of the Ets-2 repressor in order to finally achieve the transcription of its genome. For this reason, we compared Ets-2 mRNA expression levels between Jurkat and J Lat cells cultured in the absence and presence of mitogens. Jurkat cells mimic naive T helper lymphocytes, while J Lat cell line carry in their genome an inactively infectious version of the HIV-1 genome (viral reservoirs). It was found that the expression of Ets-2 mRNA in J-Lat cells is higher than that in Jurkat cells, while the induced expression of IL-2 in J-Lat is lower than that in Jurkat. To test whether the differences in Ets-2 mRNA expression were due to Tat viral protein, we performed overexpression experiments in the Jurkat and Jurkat LTRG cell lines. Cells were cultured in the absence and presence of mitogens, and increased plasmid (pcDNA3 tat) concentrations were added. To detect transcriptional overexpression and expression of other genes, RNA isolation, cDNA synthesis and PCR were performed to determine the expression levels. In experiments on Jurkat cell line transfection, Ets-2 mRNA expression was increased, in both culture conditions. In the Jurkat LTRG cell line transfection experiments in the absence of mitogens, it was found that the expression of Ets-2 mRNA was increased, while in the presence of mitogens the expression of Ets-2 mRNA remained constant. In conclusion, we observe that HIV-1 virus positively regulates the expression of Ets-2 mRNA through Tat viral protein in inactivated T cell lines. Of course, further experiments at the level of protein expression and primary T helper lymphocytes are required to confirm the above results. However, these results provide the basis for new experiments that will elucidate the molecular mechanisms by which the viral Tat protein regulates the expression of the Ets-2 transcriptional repressor and its biological significance for HIV-1. 2022-03-15T11:42:57Z 2022-03-15T11:42:57Z 2021-11-30 http://hdl.handle.net/10889/16064 gr application/pdf |
