Παρασκευή λιποσωμικών μορφών που ενσωματώνουν την πρωτεΐνη Horseradish Peroxidase (HRP) με μεθόδους μικροροής (microfluidics) και μελέτες αποδέσμευσης και σταθερότητας

• Κύριος συγγραφέας: Τζιμάνης, Δημήτριος
• Άλλοι συγγραφείς: Tzimanis, Dimitrios
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2022
• Θέματα: Λιποσώματα; Πρωτεϊνικά μόρια; Liposomes; Horseradish Peroxidase (HRP)

Τα λιποσώματα είναι μικροσκοπικά σφαιρικά σωματίδια που αποτελούνται κυρίως από φωσφολιπίδια και χοληστερόλη και χρησιμοποιούνται στην Φαρμακευτική ως νανοφορείς φαρμακευτικών μορίων. Τα τελευταία χρόνια, αυξάνεται ολοένα και περισσότερο η χρήση πρωτεϊνικών μορίων για θεραπευτικούς σκοπούς. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα τους περιορίζεται από παράγοντες όπως η μειωμένη σταθερότητα, ο χαμηλός χρόνος ημιζωής και η ανοσογονικότητα. Ο εγκλωβισμός σε λιποσώματα, έχει προταθεί σε πολλές περιπτώσεις ως τρόπος επίλυσης των παραπάνω περιορισμών. Σκοπός της συγκεκριμένης Μεταπτυχιακής Διπλωματικής Εργασίας ήταν η πραγματοποίηση μελετών σταθερότητας και κινητικής αποδέσμευσης σε λιποσωμικές μορφές μιας πρωτεΐνης, με κύριο στόχο τη διερεύνηση της ικανότητας των λιποσωμάτων να προστατεύουν ευαίσθητα πρωτεϊνικά μόρια έναντι της απώλειας της δραστικότητάς τους. Η πρωτεΐνη που επιλέχθηκε να εγκλωβιστεί στους λιποσωμικούς φορείς ήταν η Υπεροξειδάση του Χρένου (Horseradish Peroxidase). Αρχικά, παρασκευάστηκαν λιποσώματα που εγκλωβίζουν HRP με χρήση τεχνικής ανάμιξης με μικροροή (Microfluidics). Οι λιπιδικές συστάσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: DSPC/Chol/PEG 1:1:0,08, PC/Chol/PEG 1:1:0,08 και PC/Chol 1:1. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα βελτιστοποίησης (optimization), ώστε να βρεθούν οι βέλτιστες συνθήκες ανάμιξης για την κάθε λιπιδική σύσταση. Στην συνέχεια, τα λιποσώματα χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος, το δείκτη πολυδιασποράς και το ζήτα δυναμικό τους με χρήση μεθόδου DLS. Επιπλέον, για κάθε λιπιδική σύσταση βρέθηκε και το ποσοστό της αποτελεσματικότητας εγκλωβισμού του HRP στα λιποσώματα. Ύστερα, ακολούθησαν οι μελέτες σταθερότητας και κινητικής απελευθέρωσης της πρωτεΐνης από τα λιποσώματα. Για τις μελέτες σταθερότητας, σε διάφορα χρονικά σημεία λαμβάνονταν ποσότητα κάθε δείγματος και προσδιορίζονταν το ποσοστό του σταθερού HRP, μέσω σύγκρισης του λόγου Δραστικότητα HRP/Συγκέντρωση HRP σε σχέση με την τιμή του λόγου αυτού για την ημέρα 0. Συγκρίθηκαν τα ποσοστά σταθερού HRP μεταξύ του λιποσωμικού και του ελεύθερου ενζύμου και εξετάστηκε η επίδραση της θερμοκρασίας και της αρχικής συγκέντρωσης HRP στην σταθερότητα. Όσον αφορά τις μελέτες κινητικής αποδέσμευσης, αυτές πραγματοποιήθηκαν μέσω επώασης λιποσωμικών δειγμάτων HRP στους 37oC. Σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία, λαμβάνονταν ποσότητα από κάθε δείγμα και το μη-εγκλωβισμένο HRP διαχωρίζονταν από το εγκλωβισμένο μέσω χρωματογραφικής στήλης μοριακού αποκλεισμού. Μετρώντας το HRP που παραμένει εγκλωβισμένο, ήταν δυνατός ο υπολογισμός του ποσοστού της πρωτεΐνης που απελευθερώνονταν σε κάθε χρονικό σημείο από τα λιποσώματα. Μέσω των αποτελεσμάτων, συγκρίθηκε η κινητική αποδέσμευσης του ενζύμου στις τρεις λιπιδικές συστάσεις. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι με την χρήση της τεχνικής ανάμιξης με μικροροή, το HRP εγκλωβίζεται στα λιποσώματα και των 3 λιπιδικών συστάσεων σε υψηλό ποσοστό, της τάξης του 70%. Το μέγεθος των λιποσωμάτων ήταν της τάξης των 100nm με τιμές PDI κάτω από 0,25 ενώ το ζ δυναμικό ήταν σχεδόν μηδενικό καθώς κανένα από τα λιπίδια δεν προσδίδει φορτίο. Όσον αφορά τις μελέτες σταθερότητας, η λιποσωμική μορφή (στις δύο λιπιδικές συστάσεις που χρησιμοποιήθηκαν) φάνηκε να προστατεύει το HRP σε σχέση με την ελεύθερη τόσο στους 4oC όσο και στους 37oC, σε δύο διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις (70 και 200 ppm). Η σταθερότητα του ενζύμου επηρεάζονταν από την αρχική του συγκέντρωση καθώς, τόσο η ελεύθερη όσο και η λιποσωμική μορφή έχαναν πιο αργά την σταθερότητά τους, και στις δύο θερμοκρασίες, σε αρχική συγκέντρωση 200 ppm σε σύγκριση με τα 70 ppm. Επιπλέον, η σταθερότητα του ενζύμου επηρεάζονταν και από την θερμοκρασία καθώς σε όλα τα πειράματα η δραστικότητα του HRP χάνονταν ταχύτερα στους 37oC σε σχέση με τους 4oC. Τέλος, συγκρίνοντας τις δύο λιπιδικές συστάσεις, προκύπτει ότι ο εγκλωβισμός σε λιποσώματα σύστασης DSPC/Chol/PEG 1:1:0,08 προστάτευσε καλύτερα το HRP σε σχέση με τη σύσταση PC/Chol/PEG 1:1:0,08. Όσον αφορά τις μελέτες κινητικής απελευθέρωσης, προέκυψε ότι σε όλες τις λιπιδικές συστάσεις, το HRP απελευθερώνονταν με αργό ρυθμό από τα λιποσώματα αφού ένα ποσοστό 50 ως 75% του αρχικά εγκλωβισμένου ενζύμου είχε απελευθερωθεί από τα λιποσώματα μέσα σε 40 ημέρες. Συγκρίνοντας τις 3 λιπιδικές συστάσεις, προέκυψε ότι η απελευθέρωση του HRP είναι πιο αργή στα λιποσώματα που έχουν DSPC στην σύστασή τους.