Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου Cdt1 και Geminin σε ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς

• Κύριος συγγραφέας: Συμεωνίδου, Ιωάννα Ελένη
• Άλλοι συγγραφείς: Λυγερού, Ζωή
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2009
• Θέματα: Καρκίνος; Κυτταρικός κύκλος; Cancer; Cell cycle; Cdt1; Geminin; 571.84

Η αδειοδότηση της αντιγραφής διασφαλίζει την ακεραιότητα της γενετικής πληροφορίας κατά τη μεταβίβασή της στα θυγατρικά κύτταρα και εξασφαλίζει ότι το DNA αντιγράφεται μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια του ίδιου κυτταρικού κύκλου. Η πρωτεΐνη Cdt1 αποτελεί σημαντικό παράγοντα αδειοδότησης και συσσωρεύεται κατά τη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Φυσικός αναστολέας της Cdt1 είναι η Geminin, που εκφράζεται καθ’όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, εκτός από τη G1. Η διατήρηση της ισορροπίας της έκφρασης των πρωτεϊνών Cdt1 και Geminin είναι σημαντική για τη διασφάλιση της γενετικής ακεραιότητας. Αποσιώπηση της Geminin ή υπερέκφραση της Cdt1 μπορεί να οδηγήσει σε εκτοπική επανέναρξη της αντιγραφής. Σε ποντίκια, η υπερέκφραση της Cdt1 συμβάλλει στην εμφάνιση κακοήθειας, γεγονός που αποδεικνύει το ρόλο της πρωτεΐνης ως ογκογονίδιο. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι μόρια που συμμετέχουν στο μηχανισμό αδειοδότησης της αντιγραφής μπορούν να χρησιμεύσουν ως προγνωστικοί-διαγνωστικοί δείκτες. Υψηλά επίπεδα έκφρασης των MCMs και της Geminin έχουν παρατηρηθεί σε διάφορες κακοήθειες και έχουν συσχετιστεί με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της ασθένειας. Αν και έχει δειχθεί ότι η Cdt1 διαθέτει ογκογόνο δράση, ελάχιστα δεδομένα είναι διαθέσιμα, μέχρι στιγμής, αναφορικά με τα επίπεδα έκφρασής της σε κακοήθεις καταστάσεις και με την πιθανή χρήση της ως βιολογικού δείκτη. Αρχικός στόχος αυτής της εργασίας ήταν η έκφραση ενός τμήματος της Cdt1 πρωτεΐνης για την ανοσοποίηση κουνελιών και την παραγωγή αντισώματος. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε έκφραση της υβριδικής GST-C391 hCdt1 πρωτεΐνης σε ετερόλογο βακτηριακό σύστημα έκφρασης. Παράλληλα πραγματοποιήθκε έκφραση ενός ακόμη τμήματος της hCdt1 που έφερε τον επίτοπο His. Η δεύτερη υβριδική πρωτεΐνη (His-ΔΝ Cdt1) χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό των αντιορρών των ανοσοποιημένων ζώων και την απομόνωση του αντισώματος. Η ειδικότητα του καθαρισμένου αντισώματος πιστοποιήθηκε με ανοσοφθορισμό και ανοσοαποτύπωση western σε δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, στα HeLa και στα MCF7. Επιπλέον, πειράματα ανοσοϊστοχημειας σε τομές από περιστατικά καρκίνου μαστού επιβεβαίωσαν τη δυνατότητα χρήσης του αντισώματος σε ιστικές τομές παραφίνης. Η εξέταση των πρωτεϊνικών επιπέδων έκφρασης της Cdt1 έδειξε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης στον όγκο σε σχέση με τον παρακείμενο φυσιολογικο ιστό. Επιπλέον, στην παρούσα εργασία προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των Cdt1 και Geminin, με τη μέθοδο της Real-Time PCR, σε δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές (HeLa και MCF7) και σε πρωτογενείς ανθρώπινους ινοβλάστες. Διαπιστώθηκε αύξηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA του Cdt1 κατά δύο φορές στις δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, σε σχέση με τους ινοβλάστες. Αντίθετα, η Geminin, εκφράζεται περισσότερο κατά δύο φορές στα HeLa σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα, ενώ στα MCF7 τα επίπεδά της είναι υποδιπλάσια σε σχέση με τους ινοβλάστες. Επομένως, ο λόγος των Cdt1/Geminin επηρεάζεται με διαφορετικό τρόπο στις δύο καρκινικές σειρες: στα HeLa φαίνεται ότι διατηρείται σταθερός, σε σχέση με τους ινοβλάστες, ενώ στα MCF7 παρουσιάζεται τετραπλάσιος.