Μελέτη μηχανισμών μέσω των οποίων ο μεταγραφικός παράγοντας COUP-TFII επηρεάζει την καρδιαγγειακή παθοφυσιολογία

• Κύριος συγγραφέας: Δάφνη, Χριστίνα
• Άλλοι συγγραφείς: Dafni, Christina
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2022
• Θέματα: Φλεγμονή; Μονοξείδιο του αζώτου; Απολιποπρωτεΐνες; Αγγειακά ενδοθήλια; Φλέβες; Ηπατοκύτταρα; COUP-TFII; Inflammation; Nitric oxide; Apolipoproteins; Apo-AI; CIA2; Vascular endotheliums; Veins; Liver; Hepatocytes

Ο πυρηνικός υποδοχέας Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor II (COUP-TFII) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που εκφράζεται ευρέως κατά την εμβρυογένεση, αλλά συνεχίζει να εκφράζεται σταθερά σε πολλούς ιστούς καθ’ όλη τη διάρκεια της ενήλικης ζωής, παίζοντας σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης, το μεταβολισμό και άλλες διεργασίες απαραίτητες για την ομοιοστασία του οργανισμού. Θεωρείται ορφανός υποδοχέας, δυσχεραίνοντας σημαντικά την φαρμακολογική έρευνα στο πεδίο, ενώ μόλις πρόσφατα έχει ταυτοποιηθεί πιθανός ενδογενής συνδέτης του και πιθανοί αναστολείς του. Μεταξύ των ιστών που εκφράζεται ο COUP-TFII ξεχωρίζει το φλεβικό και λεμφικό ενδοθήλιο, καθώς η παρουσία του είναι απαραίτητη για τον καθορισμό και την διατήρηση των μορφολογικών χαρακτηριστικών και της λειτουργικότητας τους, καταστέλλοντας το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch. Επειδή ο άξονας του μονοξειδίου του αζώτου φαίνεται να ελέγχεται από την ενεργότητα του Notch, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι και ο COUP-TFII θα μπορούσε να ρυθμίζει τον άξονα NO-sGC-cGMP, πιθανόν μέσω αναστολής του Notch μονοπατιού. Τα επίπεδα του COUP-TFII έχουν επίσης συσχετιστεί με τη φλεγμονώδη απόκριση και διάφορες ινωτικές διεργασίες, οι οποίες εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία νόσων όπως η αθηροσκλήρωση και είναι αυξημένα στο ήπαρ, στο οποίο έχει προσφάτως συσχετιστεί με παθολογικές καταστάσεις, όπως η ίνωση. Στο παρελθόν, ο COUP-TFII έχει συσχετιστεί με ρύθμιση της έκφρασης των απολιποπρωτεϊνών Apo-AI, -AII, AIV, Apo-B και Apo-CIII, κύριων πρωτεϊνικών συστατικών λιποπρωτεϊνών όπως η HDL και LDL, και μάλιστα σε αρχικά στάδια της μελέτης του είχε ταυτοποιηθεί ως ρυθμιστική πρωτεΐνη-1 της απολιποπρωτεΐνης Apo-AI (Apo-AI Regulatory Protein-1, ARP-1). Ωστόσο, η συσχέτιση αυτή θεωρείται αβέβαιη, καθώς σε καμία περίπτωση δεν έχει μελετηθεί η επίδραση του COUP-TFII σε επίπεδο πρωτεΐνης ή mRNA, αλλά μόνο στην δυνατότητα του να συνδέεται στον υποκινητή αυτών. Πρόσφατα, ταυτοποιήθηκε μία ομάδα αναστολέων του COUP-TFII, οι οποίοι χαρακτηρίστηκαν ως CIA αναστολείς (COUP-TFII inhibitor A). Τα δύο μόρια CIA (CIA1 και CIA2) αποτελούν πιθανά φαρμακολογικά εργαλεία για τη στόχευση του COUP-TFII. Ωστόσο, υπάρχει μόνο μία σχετική δημοσίευση και απαιτείται περαιτέρω χαρακτηρισμός τους τους για την πειραματική τους χρήση και για την ανάπτυξη επιπλέον αναλόγων βασιζόμενων σε αυτά τα δύο μόρια. Σκοπό της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτελεί η μελέτη μηχανισμών μέσω των οποίων ο μεταγραφικός παράγοντας COUP-TFII επηρεάζει την καρδιαγγειακή παθοφυσιολογία. Συγκεκριμένα, στόχος μου ήταν να συνδράμω: (1) στη διασαφήνιση του ρόλου και της έκφρασης του COUP-TFII στο αγγειακό ενδοθήλιο κάτω από φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές καταστάσεις και (2) στον χαρακτηρισμό της δράσης του COUP-TFII στη ρύθμιση της έκφρασης πρωτεϊνών σε ηπατοκύτταρα, των οποίων η έκφραση τροποποιείται σε αθηρομεταβολικές νόσους, όπως οι απολιποπρωτεΐνες. Ο μικρομοριακός αναστολέας CIA2 αποτέλεσε το κύριο ερευνητικό εργαλείο στην παρούσα μελέτη, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις έγιναν παράλληλες δοκιμασίες με αποσιώπηση του COUP-TFII με ειδικό siRNA. Ο CIA2, καθότι δεν ήταν διαθέσιμος εμπορικώς, συντέθηκε από την ερευνητική ομάδα του Αν. Καθηγητή κ. Φουστέρη. Ο ρόλος του COUP-TFII στο αγγειακό ενδοθήλιο μελετήθηκε in vitro σε πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs και αξιολογήθηκε η επίδρασή του (α) στην διέγερση της παραγωγής του σημαντικού σηματοδοτικού μορίου cGMP, (β) τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και (γ) την τροποποίηση φλεγμονωδών αποκρίσεων. Ο CIA2 (10μM) αύξησε σε κύτταρα HUVECs την απόκριση σε αγωνιστές της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης (sGC) αλλά και την παραγωγή cGMP από μεμβρανικούς υποδοχείς με ενεργότητα γουανυλικής κυκλάσης (pGC), όπως υποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα cGMP (κατά 2 - 3,5 fold) και της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης pVASP (κατά ≈40%). Τα δεδομένα αυτά σε συνδυασμό με προηγούμενες και παράλληλες δοκιμές (Β. Βαζούρα) στις οποίες είχε πραγματοποιηθεί αποσιώπηση του COUP-TFII με ειδικό siRNA, υποδεικνύουν ότι ο ενδογενής COUP-TFII καταστέλλει την παραγωγή cGMP. Παρόλα αυτά, αναστολή του COUP-TFII με τον CIA2 στην επιθηλιακή κυτταρική σειρά LNCaP μείωσε τις αντίστοιχες αποκρίσεις (κατά ≈50%), πράγμα που σημαίνει ότι η συγκεκριμένη επίδραση του CIA2 εξαρτάται από το κυτταρικό υπόβαθρο. Επιπλέον, προσθήκη του CIA2 προκαλεί μείωση της βιωσιμότητας/πολλαπλασιασμού (δοκιμασία MTT) των ενδοθηλιακών κυττάρων (κατά ≈20%), κάτι που συνάδει με δημοσιευμένα αποτελέσματα και με την χρήση siRNA. Τέλος, τα επίπεδα του COUP-TFII μειώθηκαν σημαντικά ύστερα από επίδραση με προφλεγμονώδεις και προ-ινωτικές κυτταροκίνες TNFα, IL-1β και TGF-β1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs (κατά 50-65%). Λαμβάνοντας υπόψιν προηγούμενα δεδομένα της ερευνητικής μας ομάδας σύμφωνα με τα οποία αποσιώπηση του COUP-TFII με siRNA αύξησε προφλεγμονώδεις αποκρίσεις των HUVECs, συμπεραίνουμε ότι η παρουσία προφλεγμονωδών κυτταροκινών προκαλεί την εδραίωση ενός φλεγμαίνοντος περιβάλλοντος όχι μόνο μέσω της άμεσης ενεργοποίησης του NF-κB αλλά και έμμεσα, μειώνοντας τα επίπεδα του COUP-TFII, του οποίου η παρουσία φαίνεται να καταστέλλει τη φλεγμονή. Ο ρόλος του COUP-TFII στον έλεγχο και τη ρύθμιση έκφρασης πρωτεϊνών σημαντικών για τις καρδιαγγειακές λειτουργίες, όπως οι απολιποπρωτεΐνες, μελετήθηκε in vitro χρησιμοποιώντας ως πρότυπο ηπατοκύτταρα HepG2, όπου είτε έγινε αποσιώπηση του COUP-TFII με ειδικό siRNA ή χορηγήθηκε ο αναστολέας CIA2 και -σε πολύ αρχικά πειράματα- in vivo σε μύες C57BL/6J που χορηγήθηκε ο CIA2 (0,25μg/kg/ημέρα) για 7 ημέρες. Τεχνικές Western και RT-qPCR χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστούν τα πρωτεϊνικά επίπεδα και η έκφραση σε επίπεδο mRNA των απολιποπρωτεϊνών Apo-AI, -B, -CIII. Αποσιώπηση του COUP-TFII σε κύτταρα HepG2 με siRNA οδήγησε σε αύξηση των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνικών επιπέδων της Apo-AI κατά 47% (48h) και των εκκρινόμενων επιπέδων της στις 24h και 48h κατά 258% και 49% αντίστοιχα, και μείωση των επιπέδων mRNA της Apo-B κατά 23% (24h), επιβεβαιώνοντας για πρώτη φορά ευθέως ότι ο COUP-TFII δρα ως καταστολέας της έκφρασης της Apo-AI, συμφωνώντας με τα υπαινικτικά δεδομένα της υπάρχουσας βιβλιογραφίας, ενώ φαίνεται να επάγει την έκφραση της Apo-B, σε αντίθεση με ότι είχε αναφερθεί μέχρι σήμερα. Απεναντίας, επίδραση με τον CIA2 φάνηκε να προκαλεί διαφορετικό αποτέλεσμα: το CIA2 προκάλεσε μείωση των επιπέδων της Apo-AI και Apo-B, είτε σε κύτταρα HepG2 (της τάξης του 80-90% και 35% αντίστοιχα) ή στο πλάσμα και ήπαρ μυών, in vivo, ενώ τα επίπεδα της Apo-CIII δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά μετά από in vivo χορήγηση. Συμπερασματικά, αναφέρουμε ότι: (α) ο COUP-TFII συμμετέχει ενεργά σε παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς του ενδοθηλίου, που εμπλέκονται στην έναρξη και τροποποίηση νόσων του καρδιαγγειακού, όπως η αθηροσκλήρωση και η καρδιακή ίνωση, επηρεάζοντας την απόκριση του σηματοδοτικού μονοπατιού του NO, και τροποποιώντας φλεγμονώδεις και ινωτικές διεργασίες. Ο COUP-TFII εμπλέκεται σε έναν αναδραστικό κύκλο όταν υπάρχει έκθεση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, καθώς φαίνεται ότι η φλεγμονώδης απόκριση μειώνει τα επίπεδα του, και αυτή η μείωση εδραιώνει περαιτέρω τη φλεγμονή. (β) ο COUP-TFII ελέγχει όντως την ηπατική έκφραση των γονιδίων των απολιποπρωτεϊνών Apo-AI, Apo-B και Apo-CIII, κύριων πρωτεϊνικών συστατικών των HDL και LDL: καταστέλλει την έκφραση της Apo-AI, αυξάνει την έκφραση της απολιποπρωτεΐνης Apo-B, ενώ δεν φάνηκε να μεταβάλει σημαντικά τα επίπεδα της Apo-CIII. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες και μεγαλύτερος αριθμός πειραματόζωων για διεξαγωγή ασφαλούς συμπεράσματος. (γ) Ο αναστολέας CIA2, σε ορισμένες περιπτώσεις παρουσιάζει παρόμοια δράση με την αποσιώπηση του COUP-TFII με siRNA (πχ ενίσχυση του άξονα του NO σε ενδοθηλιακά κύτταρα), αλλά αυτό φαίνεται να εξαρτάται από το κυτταρικό υπόβαθρο, πιθανόν εξαιτίας διαφορετικής δυνατότητας πρόσδεσης και αναστολής των διαφόρων ισομορφών COUP-TFII ή κάποιου παράπλευρου μηχανισμού δράσης του μορίου. Ως εκ τούτου, θέτουμε υπό αμφισβήτηση δημοσιευμένα δεδομένα όπου παρουσιάζεται ως εκλεκτικός αναστολέας του COUP-TFII. Κατά συνέπεια, ο ρόλος του ως φαρμακολογικού εργαλείου μελέτης του COUP-TFII και, ανεξάρτητα, των καρδιαγγειακών και μεταβολικών νοσημάτων, κρίνεται μεν σημαντικός, καθώς παρουσιάζει σημαντική βιοενεργότητα in vitro και in vivo, αλλά χρειάζονται περαιτέρω μελέτες του προφίλ της δράσης του και προσδιορισμός των πιθανών παράπλευρων μηχανισμών δράσης του.