Μελέτη της αύξησης μικροφυκών σε ανακυκλώσιμα νερά ιχθυοτροφείων και παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας

• Κύριος συγγραφέας: Ντούρου, Μαριάννα
• Άλλοι συγγραφείς: Dourou, Marianna
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2022
• Θέματα: Μικροφύκη; Πολυακόρεστα λιπαρά οξέα; Εργαστηριακή προσαρμοστική εξέλιξη; Βιοαντιδραστήρες; Microalgae; Polyunsaturated fatty acids; Adaptive laporatory evolution; Bioreactors

H βιομάζα των μικροφυκών είναι πλούσια σε βιοδραστικές ενώσεις υψηλού βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος, με πολλαπλές εμπορικές εφαρμογές κι έτσι τα τελευταία χρόνια η καλλιέργειά τους σε μεγάλη κλίμακα έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον ερευνητών και παραγωγικών μονάδων. Ωστόσο, η βιωσιμότητα της διαδικασίας επηρεάζεται αρνητικά από το υψηλό κόστος του μέσου καλλιέργειας και από τους τεράστιους όγκους νερού οι οποίοι απαιτούνται για την καλλιέργεια μικροφυκών. Από την άλλη, ο κλάδος της υδατοκαλλιέργειας, ολοένα και αυξανόμενος, συνδέεται με επιβλαβείς επιπτώσεις στους υδροφόρους ορίζοντες, εξαιτίας των υγρών αποβλήτων τα οποία παράγει. Αποτελεσματική εναλλακτική προσέγγιση για την αύξηση της βιωσιμότητας της διαδικασίας αποτελεί η αξιοποίηση των υγρών αποβλήτων υδατοκαλλιέργειας ως μέσο ανάπτυξης μικροφυκών. Για τους σκοπούς της παρούσας διατριβής, παραλήφθηκαν τρία υγρά απόβλητα από δεξαμενές εκτροφής ιχθύων διαφορετικού σωματικού βάρους από Ελληνική μονάδα ιχθυοκαλλιέργειας και ένα ακόμη από την κεντρική δεξαμενή καθίζησης της ιδίας εταιρίας. Σύμφωνα με τα προκαταρκτικά πειράματα, το απόβλητο προερχόμενο από τη δεξαμενή καθίζησης (effluent from the sedimentation tank, EST) αποδείχθηκε το καταλληλότερο να υποστηρίξει την αύξηση του μικροφύκους Nannochloropsis gaditana, σε καλλιέργειές του σε κωνικές φιάλες. Η χημική του σύσταση εμφάνισε εξάρτηση από το μέγεθος των εκτρεφόμενων ιχθύων. Πιο συγκεκριμένα, μήνες κατά τους οποίους στη μονάδα εκτρέφονταν ιχθύες μικρού σωματικού βάρους, στη δεξαμενή καθίζησης κατέληγαν λύματα πλούσια σε φώσφορο (P), έτσι ο ο λόγος Ν/P του αποβλήτου σε μία περίοδο παραλαβής ήταν 20,9 (μοναδική τιμή). Αντίθετα, όταν εκτρέφονταν ιχθύες μεγάλου σωματικού βάρους, στη δεξαμενή καθίζησης κατέληγαν λύματα στα οποία ο P βρισκόταν σε πενία, ενώ οι αζωτούχες ενώσεις σε περίσσεια. Συγκεκριμένα, σε δύο περιόδους παραβής, ο λόγος N/P ισούνταν με 1333,4 και 298,4 (μοναδικές τιμές). Βάσει των ανωτέρω, τα απόβλητα της ιχθυοκαλλιέργειας χαρακτηρίστηκαν στην παρούσα διατριβή ως πλούσια (EST_P+) και περιοριστικά (EST_P-) σε φώσφορο. Σύμφωνα με προκαταρκτικά πειράματα καλλιέργειας μικροφυκών σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer υπό συνεχή φωτισμό και περιοδική ανάδευση, η ανάπτυξη των στελεχών N. oculata και Nannochloropsis sp. παρεμποδίστηκε από τη χημική σύσταση του EST_P+, ενώ τα είδη N. atomus, N. gaditana, Tetraselmis suecica και Tisochrysis lutea αναπτύχθηκαν ικανοποιητικά σε αυτό. Τα ικανά να αναπτυχθούν στο EST_P+ στελέχη μικροφυκών καλλιεργήθηκαν σε δύο τύπους εργαστηριακού φωτο-βιοαντιδραστήρα υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι, προκειμένου να ελεγχθεί η επίδραση διαφόρων παραμέτρων στην αύξηση και τη φυσιολογία τους. Στον προσομοιάζοντα με ανοικτή δεξαμενή φωτο-βιοαντιδραστήρα (open pond simulationg reactor, OPSR) η ροή παροχής αέρα ήταν 150 L/h, η ένταση φωτισμού 245 μmol m-2 s-1 και η ανάδευση πραγματοποιούνταν μέσω μικρής αντλίας με ροή 150 L/h. Από την άλλη, στον φωτο-βιοαντιδραστήρα κλειστού τύπου (stirred tank reactor, STR) η ροή παροχής αέρα ήταν χαμηλότερη (= 37,5 L/h), η ένταση του φωτός ισχυρότερη (= 1636 μmol m-2 s-1) και η ανάδευση πιο ομοιόμορφη, κάτι το οποίο εξασφαλιζόταν από τα δύο στροφεία ανάδευσης έξι περιστρεφόμενων πτερυγίων, τα οποία διαθέτει ο βιοαντιδραστήρας. Επίσης πραγματοποιήθηκαν και καλλιέργειες-ελέγχου των ανωτέρω στελεχών μικροφυκών στον φωτο-βιοαντιδραστήρα OPSR σε μέσο καλλιέργειας τεχνητό θαλασσινό νερό (artificial seawater, ASW) περιοριστικό σε φώσφορο (ASW_P-), το οποίο έχει χαμηλότερη αλατότητα (= 27,0 g/L) από το υγρό απόβλητο. Η μέγιστη παραγωγή ξηρής βιομάζας (dry cell mass, x) από το είδος N. gaditana (x = 847,0 mg/L με παραγωγικότητα Px = 180 mg/L*d) παρατηρήθηκε όταν καλλιεργήθηκε σε μέσο καλλιέργειας EST_P+ στον φωτο-βιοαντιδραστήρα STR. Αντίθετα, η μέγιστη συσσώρευση λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας (lipids in the dry cell mass, L/x), δηλαδή L/x = 24,7%, παρατηρήθηκε όταν το στέλεχος καλλιεργήθηκε σε μέσο ανάπτυξης EST_P-. Έτσι, και τα υπόλοιπα υπό μελέτη στελέχη μικροφυκών καλλιεργήθηκαν σε περιοριστικό σε P απόβλητο. Η πενία P σε συνδυασμό με την υψηλή αλατότητα του EST_P- επηρέασε αρνητικά την παραγωγή ξηρής βιομάζας συγκριτικά με τις καλλιέργειές τους στο ASW_P-, στον φωτο-βιοαντιδραστήρα OPSR. Πιο συγκεκριμένα, το N. atomus παρήγαγε x = 84,0 mg/L (έναντι 156,3 mg/L στο ASW_P-), το T. suecica x = 263,3 mg/L (έναντι 724,0 mg/L στο ASW_P-) και το T. lutea x = 128,1 mg/L (έναντι 193,1 mg/L στο ASW_P-). Η παραγόμενη βιομάζα ωστόσο, ήταν περισσότερο πλούσια σε αποθεματικά μόρια. Συγκεκριμένα, ευνοήθηκε σημαντικά η συσσώρευση λιπιδίων και πολυσακχαριτών (polysaccharides in the dry cell mass, S/x) στο είδος N. atomus, αφού L/x = 36,2 και S/x = 33,8% (έναντι 11,7 και 8,7%, αντίστοιχα στο ASW_P-). Παρόμοια, το T. lutea συσσώρευσε L/x = 36,5 και S/x = 26,8% καλλιεργούμενο στο EST_P- (έναντι 16,4 και 9,6%, αντίστοιχα στο ASW_P-). Στο είδος T. suecica επηρεάστηκε σημαντικά μόνο η συσσώρευση πολυσακχαριτών (S/x = 42,9% στο EST_P-). Το περιεχόμενο σε πρωτεΐνες (proteins in the dry cell mass, P/x) δεν επηρεάστηκε από το μέσο καλλιέργειας και παρέμεινε σε υψηλά ποσοστά σε κάθε περίπτωση. Το απόβλητο EST_P- επηρέασε τη σύσταση των ολικών λιπιδίων (total lipids - TL) σε λιπιδιακά κλάσματα, κι έτσι στα TL των N. gaditana, N. atomus και T. suecica υπερέχον λιπιδιακό κλάσμα ήταν αυτό των ουδέτερων λιπιδίων (neutral lipids, NL). Αντίθετα, κατά την καλλιέργειά τους στο ASW_P- υπερέχον λιπιδιακό κλάσμα ήταν αυτό των γλυκο- και σφιγγολιπιδίων (glycolipids + sphingolipids, G+S). Τέτοια επίδραση δεν παρατηρήθηκε στα TL του T. lutea. Επιπροσθέτως, το αποβλήτο επηρέασε το προφίλ σε λιπαρά οξέα των TL και την κατανομή των λιπαρών οξέων στα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα, αφού αναστάλθηκε η βιοσύνθεση των n-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) και ο δείκτης ακορεστότητας (unsaturated index, U.I.), όπως και ο λόγος n-3/n-6 εμφάνισαν μειωμένες τιμές στα TL και τα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα των ειδών N. gaditana, N. atomus και T. suecica. Εξαίρεση αποτέλεσε το στέλεχος T. lutea, στο οποίο τα ΣPUFAs και Σn-3 αυξήθηκαν στα πολικά κλάσματα κατά την καλλιέργειά του στο απόβλητο. Παρά την υψηλή ένταση φωτισμού, η οποία επικρατούσε στον φωτο-βιοαντιδραστήρα STR, δεν παρατηρήθηκαν φαινόμενα αναστολής της αύξησης για κανένα από τα υπό εξέταση μικροφύκη. Αντίθετα, οι συνθήκες οι οποίες επικρατούσαν στον STR ευνόησαν την παραγωγή ξηρής βιομάζας συγκριτικά με τις συνθήκες στον OPSR, ενώ η συσσώρευση αποθεματικών μορίων παρέμεινε σε υψηλά ποσοστά και αυτό ισχύει για όλα τα μικροφύκη, καλλιεργούμενα στο EST_P-. Ωστόσο, το σύστημα καλλιέργειας επηρέασε τη σύσταση των λιπιδίων και λιπιδιακών κλασμάτων σε λιπαρά οξέα. Οι συνθήκες ανάπτυξης στον φωτο-βιοαντιδραστήρα STR ευνόησαν τη βιοσύνθεση του C14:0 από το N. gaditana και του C18:3 n-3 από το N. atomus, ενώ παρατηρήθηκε αναστολή της βιοσύνθεσης του C18:1 n-7 από το T. suecica και του C14:1 n-5 από το T. lutea. Μελετήθηκε επίσης η επίδραση της φωτοπεριόδου στην παραγωγή βιομάζας και μεταβολικών προϊόντων από το μικροφύκος N. gaditana καλλιεργούμενο σε μέσο ανάπτυξης EST_P-. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, υπό φωτοπερίοδο 12 h φως : 12 h σκοτάδι δεν ευνοήθηκε η αύξηση του μικροφύκους (x = 62,8 mg/L). Όμως, η συσσώρευση λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας ευνοήθηκε υπό φωτοπερίοδο 16 h φως : 8 h σκοτάδι (L/x = 30,6%) συγκριτικά με την καλλιέργεια του μικροφύκους υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι. Στο μικροφύκος N. gaditana, εξετάστηκε επίσης και η επίδραση του αρχικού εμβολίου και αποδείχθηκε ότι, ανεξαρτήτως της φωτοπεριόδου, καλλιέργεια η οποία εμβολιάστηκε με μικρό μέγεθος εμβολίου οδήγησε σε χαμηλότερης πυκνότητας καλλιέργεια, χαμηλότερη συγκέντρωση παραγόμενης βιομάζας, πλουσιότερης ωστόσο σε αποθεματικά μόρια (λιπίδια και πολυσακχαρίτες). Επιπλέον, το μικροφύκος N. gaditana καλλιεργήθηκε σε πιλοτική κλίμακα σε θερμοκρασία χαμηλότερη από αυτήν που επικρατούσε στις μελέτες στο εργαστήριο (T = 20 °C), σε μέσο ανάπτυξης EST_P-, υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι. Η παραγόμενη βιομάζα κρίθηκε ικανοποιητική (x = 403,7 mg/L), όμως το μικροφύκος συσσώρευσε σε χαμηλά ποσοστά αποθεματικά συστατικά (L/x = 10,1 και S/x = 6,4%). Ωστόσο, η χαμηλή θερμοκρασία ευνόησε τη βιοσύνθεση του λιπαρού οξέος C20:5 n-3 τόσο στα TL, όσο και στα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν επίσης η μελέτη της ικανότητας αυτότροφου μικροοργανισμού να δεσμεύσει και να αξιοποιήσει το παραγόμενο από καλλιέργεια ετερότροφου μικροοργανισμού CO2. Στέλεχος της ελαιογόνου ζύμης Yarrowia lipolytica καλλιεργήθηκε στον βιοαντιδραστήρα STR και τα παραγόμενα από το μεταβολισμό αέρια της ζύμης χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή άνθρακα σε καλλιέργειες του μικροφύκους N. gaditana και συγκρίθηκαν με καλλιέργειες-ελέγχου του μικροφύκους, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν με παροχή φυσικού αέρα. Η ζύμη Y. lipolytica καλλιεργούμενη σε σύστημα ημι-συνεχούς λειτουργίας, παρήγαγε 14,7 g/L βιομάζα, 6,1 g/L κιτρικό οξύ, συσσώρευσε L/x = 18,2%, S/x = 35,1%, P/x = 18,8%, και κατά μέσο όρο απελευθέρωνε 5,3 g/L*d CO2, το οποίο από τον 4ο κύκλο αύξησής της διοχευόταν σε δύο ανεξάρτητες μεταξύ τους καλλιέργειες του N. gaditana με ρυθμό παροχής αέρα 45 L/h. Το μικροφύκος καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer σε μέσο ανάπτυξης ASW_P- υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι. Κατά τις καλλιέργειες-ελέγχου, το πρότυπο της αύξησης του μικροφύκους ήταν γραμμικό, αντίθετα, όταν η καλλιέργεια εμπλουτίστηκε με τα αέρια της ζύμης, το πρότυπο της αύξησης άλλαξε στο τυπικό σιγμοειδές πρότυπο αύξησης υπό τον έλεγχο ενός μόνον περιοριστικού για την αύξηση παράγοντα. Ο ρυθμός δέσμευσης του CO2 (bio-sequestration rate, RCO2) δε διέφερε μεταξύ των συνθηκών αερισμού και η παραγωγικότητα του μικροφύκους, όσον αφορά στην παραγωγή βιομάζας και τη συσσώρευση αποθεματικών μορίων, ήταν χαμηλότερη όταν το μικροφύκος καλλιεργήθηκε με παροχή μίγματος αερίων της ζύμης, ενώ η παραγωγή πρωτεϊνών ήταν υψηλότερη. Έπειτα από μικροσκοπική παρατήρηση φάνηκε ότι o εμπλουτισμός με τα αέρια της ζύμης οδήγησε σε μεγαλύτερα σε μέγεθος κύτταρα του μικροφύκους, συγκριτικά με τις καλλιέργειες-ελέγχου. Παρατηρήθηκε επίσης επίδραση στη σύσταση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα, καθώς τα TL και τα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα του N. gaditana ήταν περισσότερο πολυακόρεστα, όταν το μικροφύκος καλλιεργήθηκε με CO2 προερχόμενο από το μεταβολισμό της ζύμης. Συγκεκριμένα η αύξηση της ακορεστότητας αφορούσε περισσότερο σε αύξηση του λιπαρού οξέος C20:5 n-3. Επιπλέον, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης, αποδεικνύεται ότι η βιοσύνθεση των PUFAs σχετίζεται με την αύξηση των φωτοσυνθετικών μεμβρανών και όχι με τη συσσώρευση ουδέτερων λιπιδίων, αφού C20:5 n-3(G) ήταν >20 mg/gxf , ενώ C20:5 n-3(NL) ήταν <5 mg/gxf και στις δύο συνθήκες αερισμού του N. gaditana. Επιπροσθέτως, μεταξύ των συνθηκών αερισμού δεν επηρεάστηκε σημαντικά η σχετική ενεργότητα της ελονγκάσης στο N. gaditana, αντίθετα της Δ9 αποκορεσμάσης αυξήθηκε σημαντικά στο κλάσμα των NL, ενώ της Δ12 αποκορεσμάσης μειώθηκε στο ίδιο κλάσμα. Και οι δύο αποκορεσμάσες εμφάνισαν υψηλή ενεργότητα στο κλάσμα των G, όταν η καλλιέργεια του μικροφύκους εμπλουτίστηκε με CO2 προερχόμενο από την καλλιέργεια της ζύμης. Για τους σκοπούς της παρούσας διατριβής, το είδος N. gaditana επιλέχθηκε για την ανάπτυξη στρατηγικής εργαστηριακής προσαρμοστικής εξέλιξης (adaptive laboratory evolution, ALE). Υποβλήθηκε σε 15 διαδοχικούς αυξητικούς κύκλους, οι οποίοι περιλάμβαναν την ανάπτυξή του σε συνθήκες ευνοϊκές για συσσώρευση αποθεματικών ουσιών (καλλιέργεια για 240 h σε φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι σε θρεπτικό μέσο ASW_P-), ακολουθούμενες από συνθήκες οι οποίες ευνοούν την αποδόμηση των αποθεματικών υλικών (καλλιέργεια για 240 ή 340 h σε συνθήκες σκότους ή/και απουσία CO2). Τελικά, ο εξελιγμένος/προσαρμοσμένος πληθυσμός μετά από 28,8 γενεές, παρουσίασε κατά 19,6% χαμηλότερο ρυθμό δέσμευσης του CO2 (RCO2 = 24,2 mg/L*d) συγκριτικά με το άγριο στέλεχος, με αποτέλεσμα να παρουσιαστεί μειωμένη κατά 34,4% παραγωγικότητα Px, μειωμένη κατά 8,3% συσσώρευση λιπιδίων, αυξημένη κατά 19,6% παραγωγή πρωτεϊνών, ενώ δεν εμφανίστηκε διαφορά στη συσσώρευση πολυσακχαριτών. Επιπλέον, το κλάσμα των NL μειώθηκε κατά 32,1%, ενώ το κλάσμα των PL αυξήθηκε κατά 160%. Σύμφωνα με τις φωτογραφίες των κυττάρων σε συνεστιακό μικροσκόπιο, παρατηρήθηκε ότι το μέγεθος των χλωροπλαστών μεγάλωσε κατά τις συνθήκες σκότους στους πρώτους αυξητικούς κύκλους, και με την πάροδο των γενεών το μεγάλο μέγεθος διατηρήθηκε και κατά τις συνθήκες φωτός. Επιπλέον, οι χρωστικές «μετακινήθηκαν» προς τις φωτοσυνθετικές μεμβράνες των εξελιγμένων στελεχών του N. gaditana και εκχυλίστηκαν στα πολικά κλάσματα, κυρίως στο κλάσμα των G, και όχι στο κλάσμα των NL, όπως συνέβη για το άγριο στέλεχος. Το προφίλ των TL σε λιπαρά οξέα δεν άλλαξε σε σημαντικό βαθμό. Ωστόσο, ως απόκριση στην εξελικτική πίεση στην οποία υποβλήθηκε το μικροφύκος N. gaditana, το κλάσμα των NL έγινε περισσότερο πλούσιο σε κορεσμένα λιπαρά οξέα (saturated fatty acids, SFAs) και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (monosaturated fatty acids, MUFAs), ενώ τα πολικά κλάσματα G και PL έγιναν περισσότερο πλούσια σε ΣPUFAs, με αποτέλεσμα ο δείκτης U.I. να αυξηθεί κατά 35,7 και 83,3% στο κλάσμα των G και PL, αντίστοιχα. Η αύξηση αυτή αφορούσε κυρίως σε αύξηση του C20:5 n-3(PL) από 1,1 mg (άγριο στέλεχος) σε 4,3 mg (εξελιγμένο στέλεχος). Στο τελευταίο κεφάλαιο της παρούσας διατριβής εξετάστηκε η δυνατότητα ενσωμάτωσης βιομάζας μικρο- και μακροφυκών στο σιτηρέσιο του Ευρωπαϊκού λαβρακιού (Dicentrarchus labrax). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, ενσωμάτωση ξηρής βιομάζας του μικροφύκους Nannochloropsis sp. οδήγησε σε αύξηση των n-3 λιπαρών οξέων στην νέα ιχθυοτροφή και ο λόγος n-3/n-6 αυξήθηκε κατά 75% συγκριτικά με την εμπορική ιχθυοτροφή. Η αύξηση αυτή επηρέασε τη σύσταση της σάρκας των ιχθύων, αυξάνοντας το Σn-3 κατά 17,4% και τον λόγο n-3/n-6 κατά 43,8%.