Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός του ρόλου του μεταγραφικού παράγοντα COUP-TF II σε λειτουργικές αποκρίσεις ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC in vitro

• Κύριος συγγραφέας: Βαζούρα, Βασιλική
• Άλλοι συγγραφείς: Vazoura, Vassiliki
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2022
• Θέματα: Ενδοθήλιο; Φλεγμονή; COUP-TFII; Endothelium; Inflammation; cGMP

Ο μεταγραφικός παράγοντας COUP-TFII (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcriptional Factor II) αποτελεί μέλος της υπεροικογένειας στεροειδών και θυρεοειδών ορμονών. Μέχρι πρότινος, θεωρούνταν ορφανός πυρηνικός υποδοχέας. Ωστόσο πρόσφατα, τα 1-δεοξυσφιγγολιπίδια έχουν χαρακτηριστεί ως πιθανοί ενδογενείς συνδέτες του. Φέρει την κλασική δομή των Πυρηνικών Υποδοχέων και είναι υψηλά ομόλογος με τον COUP-TFI. Οι δύο μεταγραφικοί παράγοντες έχουν κοινά μοτίβα έκφρασης κατά την εμβρυογένεση. Ωστόσο, η χαμηλή ομολογία στον αμινοτελικό τομέα τους, φαίνεται να είναι το αίτιο των διαφορετικών τους δράσεων, καθώς ο τομέας πρόσδεσης τους στο DNA είναι υψηλά ομόλογος. Ο COUP-TFII έχει χαρακτηριστεί καλά ως δείκτης της φλεβικής ενδοθηλιακής ταυτότητας μέσω καταστολής του αρτηριακού μονοπατιού του Notch. Ακόμη, εμπλέκεται στην διαφοροποίηση του λεμφικού από το φλεβικό ενδοθήλιο. Στο έμβρυο εκφράζεται κυρίως στο μεσέγχυμα και συμμετέχει στην οργανογένεση των άκρων, του διαφράγματος, της καρδιάς, του στομάχου και του ΚΝΣ. Η απαλοιφή του in vivo οδηγεί σε θνησιμότητα. Η έκφρασή του μειώνεται δραματικά με το πέρας της οργανογένεσης ενώ η επαγόμενη απαλοιφή του κατά την ενήλικη ζωή στους μύες, δεν επιφέρει σοβαρές φαινοτυπικές αλλαγές. Επίσης συμμετέχει στην αγγειογένεση, στην ρύθμιση του μεταβολισμού και στην εύρυθμη λειτουργία του αναπαραγωγικού συστήματος. Έχει συσχετιστεί με πλειάδα παθοφυσιολογιών, όπως με την ενδομητρίωση, τον διαβήτη, τον καρκίνο, την μυϊκή δυστροφία, τη συγγενή διαφραγματοκήλη, την ηπατική και τη νεφρική ίνωση. Στο καρδιαγγειακό, λειτουργεί ενορχηστρώνοντας την αυξημένη αγγειογένεση του όγκου και εμπλέκεται θετικά με την διατατική μυοκαρδιοπάθεια και την υπέρταση. Επιπλέον, έχει μερικώς χαρακτηριστεί για τις αντιφλεγμονώδεις ιδιότητές του στο φλεβικό ενδοθήλιο και εικάζεται πως η απουσία του στο αρτηριακό ενδοθήλιο αποτελεί γενετικό αίτιο της ευπάθειας των αρτηριών στην ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης. Ένας από τους στόχους της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η εκτενής αξιολόγηση του ρόλου του COUP-TFII στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC in vitro. Η συμμετοχή του στις αποκρίσεις αυτές αξιολογήθηκε και στα επιθηλιακά κύτταρα LNCaP τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως επιπλέον μοντέλο. Επιπρόσθετα, το μονοπάτι του Notch έχει φανεί ότι εμπλέκεται θετικά στην του ενεργοποίηση του μονοπατιού cGMP μέσω της sGC. Λόγω της συμμετοχής του COUP-TFII στην καταστολή του μονοπατιού του Notch, μελετήθηκε και η συμμετοχή του COUP-TFII στην ρύθμιση των επιπέδων του cGMP και της φωσφορυλίωσης του καθοδικού τελεστή του VASP στην Ser239 σε κύτταρα HUVEC και LNCaP. Για τους παραπάνω σκοπούς, μέσω μεσολαβούμενης από siRNA καταστολής του COUP-TFII μελετήθηκαν: α) τα επίπεδα των ICAM-1, P/E Selectin , phospho-p65 και η προσκόλληση των U937 λευκοκυττάρων στα HUVECs μετά από επαγωγή της ενδοθηλιακής φλεγμονής με τις κυτταροκίνες TNF-α και IL-1β, β) η επαγόμενη από TNF-α και IL-1β ενεργοποίηση του NF-κΒ μέσω του προσδιορισμού των επιπέδων του phospho-p65 αλλά και της ενεργοποίησης της μεταγραφής γονιδίου αναφοράς υπό την ρύθμιση προαγωγέα που αποκρίνεται στον NF-κΒ σε κύτταρα LNCaP, γ) τα επίπεδα του cGMP σε απόκριση στον δότη NO SNP, τον αγωνιστή της GC-Β CNP, και τους αγωνιστές της sGC ΒΑΥ-412272 και BAY-602770 στα κύτταρα HUVEC, δ) τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης VASP στην Ser239 σε απόκριση στο SNP και CNP σε κύτταρα HUVEC και ε) τα επίπεδα του cGMP επαγόμενα από τους ίδιους αγωνιστές της sGC και GC-Β στα κύτταρα LNCaP. Η αποσιώπηση αύξησε όλες τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις, προτείνοντας έναν αντιφλεγμονώδη ρόλο του παράγοντα στο ενδοθήλιο, κάτι που έρχεται σε συμφωνία με τα υπάρχοντα δεδομένα. Επιπλέον, αύξησε τα επίπεδα του cGMP αλλά και την φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης VASP στην Ser239, δείχνοντας πως ο COUP-TFII δρα καταστέλλοντας το αντιφλεγμονώδες cGMP. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με την κατασταλτική του δράση στην ενδοθηλιακή φλεγμονή, οδηγεί στο συμπέρασμα πως άλλοι μηχανισμοί υπερισχύουν έναντι της καταστολής του cGMP και επιφέρουν την αντιφλεγμονώδη λειτουργία του. Τέλος, παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και στα επιθηλιακά κύτταρα LNCaP, προτείνοντας τον ίδιο ρόλο του COUP-TFII και σε άλλα επιθηλιακά κύτταρα. Συνοπτικά, στην παρούσα διπλωματική εργασία χαρακτηρίστηκαν καλύτερα οι αντιφλεγμονώδεις δράσεις του COUP-TFII στο ενδοθήλιο. Επιπλέον, οι δράσεις αυτές δεν προήλθαν μέσω της ρύθμισης των επιπέδων του cGMP αλλά πιθανόν οφείλονται σε άλλους μηχανισμούς.