| Περίληψη: | Η ουβικιτινίωση αποτελεί ένα θεμελιώδη μετα-μεταφραστικό μηχανισμό των ευκαρυωτικών κυττάρων, όπου η διαδοχική δράση των Ε1, Ε2 και Ε3 ενζύμων οδηγεί σε σηματοδότηση των κατάλληλων υποστρωμάτων με μόρια ουβικιτίνης. Η σηματοδότηση αυτή ρυθμίζει μία ποικιλία κυτταρικών διεργασιών, όπως την αποικοδόμηση πρωτεϊνών από το πρωτεάσωμα 26S, την επιδιόρθωση του DNA, την επαγωγή της φλεγμονώδους απόκρισης και την απόπτωση. Το Ε1 ένζυμο, αρχικά, ενεργοποιεί την ουβικιτίνη η οποία μεταφέρεται στο καταλυτικό κέντρο του Ε2 ενζύμου. Στη συνέχεια, ένα Ε3 ένζυμο το οποίο φέρει το υπόστρωμα, προσεγγίζει το σύμπλοκο Ε2~Ub και η ουβικιτίνη μεταφέρεται στο υπόστρωμα. Παρότι το μονοπάτι φαίνεται απλό, ο μηχανισμός διεκπεραίωσης της ουβικιτινίωσης δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Επιπρόσθετα, οι παράγοντες οι οποίοι επηρεάζουν την Ε2-Ε3 εκλεκτικότητα και καθιστούν ένα Ε2-Ε3 σύμπλοκο λειτουργικό παραμένουν αδιευκρίνιστοι. Τα τελευταία χρόνια υποστηρίζεται ότι το Ε2~Ub σύμπλοκο βρίσκεται σε μία δυναμική ισορροπία μεταξύ δύο διαμορφωτικών καταστάσεων. Επιπλέον, η Ε3 λιγάση φαίνεται να διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη σταθεροποίηση του συμπλόκου στη προτιμητέα διαμορφωτική κατάσταση για τη μεταφορά της Ub στο υπόστρωμα.
Η Arkadia/RNF111 αποτελεί μία E3 RING λιγάση, η οποία επιτελεί τη λειτουργία της μέσω του RING-Η2 τομέα τον οποίο φέρει στο καρβοξυτελικό της άκρο. Λειτουργικά έχει αναγνωριστεί ως ο πρώτος θετικός ρυθμιστής του TGF-β μονοπατιού, καθώς είναι υπεύθυνη για την αποικοδόμηση των αρνητικών ρυθμιστών Smad7, SnoN και Ski. Η διατάραξη των επιπέδων της ίδιας και των πρωτεϊνών των οποίων ρυθμίζει στο κύτταρο, οδηγεί σε καρκινογένεση και καρδιακή ίνωση.
Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε η μελέτη της επίδρασης μεταλλάξεων συντηρημένων καταλοίπων μεταξύ των Ε2 ένζυμων, όπως της Ser22 και της Phe62 του UbcH5b, στην αλληλεπίδρασή με δύο διαφορετικού μήκους αλληλουχίες της Arkadia, καθώς και την Ub. Η αποτίμηση της επίδρασης των μεταλλάξεων στη δομή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Φασματοσκοπίας Κυκλικού Διχρωισμού και Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Επιπροσθέτως, οι αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης των μεταλλαγμάτων με τα πολυπεπτίδια ενδιαφέροντος διεξήχθησαν μέσω της Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Τέλος, η λειτουργικότητα των μεταλλαγμένων πολυπεπτιδίων ελέγχθηκε με τη μέθοδο της ουβικιτινίωσης, της ανοσοαποτύπωσης κατά Western, καθώς και της υδρόλυσης του οξυεστερικού Ε2-Ub συμπλόκου.
|
|---|
