Μελέτη μεταλλαγμάτων του Ε2 ενζύμου UbcH5b στο μηχανισμό της ουβικιτινίωσης της Ε3 λιγάσης Arkadia
Η ουβικιτινίωση αποτελεί ένα θεμελιώδη μετα-μεταφραστικό μηχανισμό των ευκαρυωτικών κυττάρων, όπου η διαδοχική δράση των Ε1, Ε2 και Ε3 ενζύμων οδηγεί σε σηματοδότηση των κατάλληλων υποστρωμάτων με μόρια ουβικιτίνης. Η σηματοδότηση αυτή ρυθμίζει μία ποικιλία κυτταρικών διεργασιών, όπως την αποικοδόμη...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2022
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | https://hdl.handle.net/10889/23951 |
| id |
nemertes-10889-23951 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Μονοπάτι ουβικιτινίωσης Ubiquitination UbcH5b Arkadia |
| spellingShingle |
Μονοπάτι ουβικιτινίωσης Ubiquitination UbcH5b Arkadia Δελέγκου, Γεωργία Μελέτη μεταλλαγμάτων του Ε2 ενζύμου UbcH5b στο μηχανισμό της ουβικιτινίωσης της Ε3 λιγάσης Arkadia |
| description |
Η ουβικιτινίωση αποτελεί ένα θεμελιώδη μετα-μεταφραστικό μηχανισμό των ευκαρυωτικών κυττάρων, όπου η διαδοχική δράση των Ε1, Ε2 και Ε3 ενζύμων οδηγεί σε σηματοδότηση των κατάλληλων υποστρωμάτων με μόρια ουβικιτίνης. Η σηματοδότηση αυτή ρυθμίζει μία ποικιλία κυτταρικών διεργασιών, όπως την αποικοδόμηση πρωτεϊνών από το πρωτεάσωμα 26S, την επιδιόρθωση του DNA, την επαγωγή της φλεγμονώδους απόκρισης και την απόπτωση. Το Ε1 ένζυμο, αρχικά, ενεργοποιεί την ουβικιτίνη η οποία μεταφέρεται στο καταλυτικό κέντρο του Ε2 ενζύμου. Στη συνέχεια, ένα Ε3 ένζυμο το οποίο φέρει το υπόστρωμα, προσεγγίζει το σύμπλοκο Ε2~Ub και η ουβικιτίνη μεταφέρεται στο υπόστρωμα. Παρότι το μονοπάτι φαίνεται απλό, ο μηχανισμός διεκπεραίωσης της ουβικιτινίωσης δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Επιπρόσθετα, οι παράγοντες οι οποίοι επηρεάζουν την Ε2-Ε3 εκλεκτικότητα και καθιστούν ένα Ε2-Ε3 σύμπλοκο λειτουργικό παραμένουν αδιευκρίνιστοι. Τα τελευταία χρόνια υποστηρίζεται ότι το Ε2~Ub σύμπλοκο βρίσκεται σε μία δυναμική ισορροπία μεταξύ δύο διαμορφωτικών καταστάσεων. Επιπλέον, η Ε3 λιγάση φαίνεται να διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη σταθεροποίηση του συμπλόκου στη προτιμητέα διαμορφωτική κατάσταση για τη μεταφορά της Ub στο υπόστρωμα.
Η Arkadia/RNF111 αποτελεί μία E3 RING λιγάση, η οποία επιτελεί τη λειτουργία της μέσω του RING-Η2 τομέα τον οποίο φέρει στο καρβοξυτελικό της άκρο. Λειτουργικά έχει αναγνωριστεί ως ο πρώτος θετικός ρυθμιστής του TGF-β μονοπατιού, καθώς είναι υπεύθυνη για την αποικοδόμηση των αρνητικών ρυθμιστών Smad7, SnoN και Ski. Η διατάραξη των επιπέδων της ίδιας και των πρωτεϊνών των οποίων ρυθμίζει στο κύτταρο, οδηγεί σε καρκινογένεση και καρδιακή ίνωση.
Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε η μελέτη της επίδρασης μεταλλάξεων συντηρημένων καταλοίπων μεταξύ των Ε2 ένζυμων, όπως της Ser22 και της Phe62 του UbcH5b, στην αλληλεπίδρασή με δύο διαφορετικού μήκους αλληλουχίες της Arkadia, καθώς και την Ub. Η αποτίμηση της επίδρασης των μεταλλάξεων στη δομή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Φασματοσκοπίας Κυκλικού Διχρωισμού και Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Επιπροσθέτως, οι αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης των μεταλλαγμάτων με τα πολυπεπτίδια ενδιαφέροντος διεξήχθησαν μέσω της Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Τέλος, η λειτουργικότητα των μεταλλαγμένων πολυπεπτιδίων ελέγχθηκε με τη μέθοδο της ουβικιτινίωσης, της ανοσοαποτύπωσης κατά Western, καθώς και της υδρόλυσης του οξυεστερικού Ε2-Ub συμπλόκου. |
| author2 |
Delegkou, Georgia |
| author_facet |
Delegkou, Georgia Δελέγκου, Γεωργία |
| author |
Δελέγκου, Γεωργία |
| author_sort |
Δελέγκου, Γεωργία |
| title |
Μελέτη μεταλλαγμάτων του Ε2 ενζύμου UbcH5b στο μηχανισμό της ουβικιτινίωσης της Ε3 λιγάσης Arkadia |
| title_short |
Μελέτη μεταλλαγμάτων του Ε2 ενζύμου UbcH5b στο μηχανισμό της ουβικιτινίωσης της Ε3 λιγάσης Arkadia |
| title_full |
Μελέτη μεταλλαγμάτων του Ε2 ενζύμου UbcH5b στο μηχανισμό της ουβικιτινίωσης της Ε3 λιγάσης Arkadia |
| title_fullStr |
Μελέτη μεταλλαγμάτων του Ε2 ενζύμου UbcH5b στο μηχανισμό της ουβικιτινίωσης της Ε3 λιγάσης Arkadia |
| title_full_unstemmed |
Μελέτη μεταλλαγμάτων του Ε2 ενζύμου UbcH5b στο μηχανισμό της ουβικιτινίωσης της Ε3 λιγάσης Arkadia |
| title_sort |
μελέτη μεταλλαγμάτων του ε2 ενζύμου ubch5b στο μηχανισμό της ουβικιτινίωσης της ε3 λιγάσης arkadia |
| publishDate |
2022 |
| url |
https://hdl.handle.net/10889/23951 |
| work_keys_str_mv |
AT delenkougeōrgia meletēmetallagmatōntoue2enzymouubch5bstomēchanismotēsoubikitiniōsēstēse3ligasēsarkadia AT delenkougeōrgia studyingtheeffectsofthee2ubch5bmutationsontheubiquitinationpathwayofarkadia |
| _version_ |
1771297309423828992 |
| spelling |
nemertes-10889-239512022-11-16T04:38:28Z Μελέτη μεταλλαγμάτων του Ε2 ενζύμου UbcH5b στο μηχανισμό της ουβικιτινίωσης της Ε3 λιγάσης Arkadia Studying the effects of the E2 UbcH5b mutations on the ubiquitination pathway of Arkadia Δελέγκου, Γεωργία Delegkou, Georgia Μονοπάτι ουβικιτινίωσης Ubiquitination UbcH5b Arkadia Η ουβικιτινίωση αποτελεί ένα θεμελιώδη μετα-μεταφραστικό μηχανισμό των ευκαρυωτικών κυττάρων, όπου η διαδοχική δράση των Ε1, Ε2 και Ε3 ενζύμων οδηγεί σε σηματοδότηση των κατάλληλων υποστρωμάτων με μόρια ουβικιτίνης. Η σηματοδότηση αυτή ρυθμίζει μία ποικιλία κυτταρικών διεργασιών, όπως την αποικοδόμηση πρωτεϊνών από το πρωτεάσωμα 26S, την επιδιόρθωση του DNA, την επαγωγή της φλεγμονώδους απόκρισης και την απόπτωση. Το Ε1 ένζυμο, αρχικά, ενεργοποιεί την ουβικιτίνη η οποία μεταφέρεται στο καταλυτικό κέντρο του Ε2 ενζύμου. Στη συνέχεια, ένα Ε3 ένζυμο το οποίο φέρει το υπόστρωμα, προσεγγίζει το σύμπλοκο Ε2~Ub και η ουβικιτίνη μεταφέρεται στο υπόστρωμα. Παρότι το μονοπάτι φαίνεται απλό, ο μηχανισμός διεκπεραίωσης της ουβικιτινίωσης δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Επιπρόσθετα, οι παράγοντες οι οποίοι επηρεάζουν την Ε2-Ε3 εκλεκτικότητα και καθιστούν ένα Ε2-Ε3 σύμπλοκο λειτουργικό παραμένουν αδιευκρίνιστοι. Τα τελευταία χρόνια υποστηρίζεται ότι το Ε2~Ub σύμπλοκο βρίσκεται σε μία δυναμική ισορροπία μεταξύ δύο διαμορφωτικών καταστάσεων. Επιπλέον, η Ε3 λιγάση φαίνεται να διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη σταθεροποίηση του συμπλόκου στη προτιμητέα διαμορφωτική κατάσταση για τη μεταφορά της Ub στο υπόστρωμα. Η Arkadia/RNF111 αποτελεί μία E3 RING λιγάση, η οποία επιτελεί τη λειτουργία της μέσω του RING-Η2 τομέα τον οποίο φέρει στο καρβοξυτελικό της άκρο. Λειτουργικά έχει αναγνωριστεί ως ο πρώτος θετικός ρυθμιστής του TGF-β μονοπατιού, καθώς είναι υπεύθυνη για την αποικοδόμηση των αρνητικών ρυθμιστών Smad7, SnoN και Ski. Η διατάραξη των επιπέδων της ίδιας και των πρωτεϊνών των οποίων ρυθμίζει στο κύτταρο, οδηγεί σε καρκινογένεση και καρδιακή ίνωση. Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε η μελέτη της επίδρασης μεταλλάξεων συντηρημένων καταλοίπων μεταξύ των Ε2 ένζυμων, όπως της Ser22 και της Phe62 του UbcH5b, στην αλληλεπίδρασή με δύο διαφορετικού μήκους αλληλουχίες της Arkadia, καθώς και την Ub. Η αποτίμηση της επίδρασης των μεταλλάξεων στη δομή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Φασματοσκοπίας Κυκλικού Διχρωισμού και Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Επιπροσθέτως, οι αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης των μεταλλαγμάτων με τα πολυπεπτίδια ενδιαφέροντος διεξήχθησαν μέσω της Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Τέλος, η λειτουργικότητα των μεταλλαγμένων πολυπεπτιδίων ελέγχθηκε με τη μέθοδο της ουβικιτινίωσης, της ανοσοαποτύπωσης κατά Western, καθώς και της υδρόλυσης του οξυεστερικού Ε2-Ub συμπλόκου. Ubiquitination is a fundamental post-translational modification of eukaryotic cells, where the sequential action of E1, E2 and E3 enzymes leads to the addition of Ubiquitin molecules to specific substrates. This pathway regulates a variety of cellular processes, such as degradation of proteins by the 26S proteasome, DNA repair, induction of the inflammatory response, and apoptosis. E1 enzyme, initially, activates Ubiquitin which is transferred to the catalytic center of E2 enzyme. An E3 enzyme carrying the substrate, afterwards, is recruited by the E2~Ub complex and catalyzes the transfer of Ubiquitin to the substrate. Although the pathway may seem simple, the exact mechanism of ubiquitination has not been fully elucidated. Additionally, the factors that affect the E2-E3 selectivity and force an E2-E3 complex to be functionally active, remain uncertain. Recently, it has been indicated that the E2~Ub complex adopts an array of dynamically different conformations. Furthermore, E3 ligase appears to play a key role in stabilizing the complex in the preferred conformation for the Ub transfer to the substrate. Arkadia/RNF111 is an E3 RING ligase, which functions through the RING-H2 domain at its carboxy terminus. It is characterized as the first positive regulator of the TGF-β pathway, as it is responsible for the degradation of the negative regulators Smad7, SnoN and Ski. Fluctuation in the cellular levels of Arkadia and Arkadia’s substrates results in cancer and cardiac fibrosis. In the current thesis, the impact of point mutations in UbcH5b E2 enzyme, on the interaction with two different constructs of Arkadia, as well as Ub, was studied. Those mutations concerned some conserved residues among E2 enzymes, such as Ser22 and Phe62 of UbcH5b. The effect of each mutation on the structure of the polypeptide was estimated through Circular Dichroism Spectroscopy and Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. In addition, the protein-protein interactions of the mutants with the polypeptides of interest were studied through Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Furthermore, the functionality of the mutants was evaluated by applying auto-ubiquitination assay, Western blotting, and oxyester E2-Ub hydrolysis assay. 2022-11-15T08:06:51Z 2022-11-15T08:06:51Z 2021-07 https://hdl.handle.net/10889/23951 gr application/pdf |
