| Περίληψη: | Το μονοπάτι ΝΟ-sGC-cGMP διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε φυσιολογικές λειτουργίες του καρδιαγγειακού – και όχι μόνο – συστήματος. Το ένζυμο της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης sGC είναι ετεροδιμερής α/β αιμοπρωτεΐνη, με επικρατέστερη την α1β1 ισομορφή της. Η ρυθμιστική περιοχή της β1 υπομονάδας περιέχει την αίμη στην H-NOX κοιλότητα της. Η πρόσδεση του ΝΟ στην H-NOX οδηγεί στην παραγωγή της κυκλικής μονοφωσφορικής γουανοσίνης (cGMP) μέσω της 5’ τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP) από την καταλυτική περιοχή του ενζύμου. Το αγγελιαφόρο μόριο cGMP επιτελεί τη δράση του με ενεργοποίηση καθοδικών μονοπατιών της πρωτεϊνικής κινάσης PKG, των φωσφοδιεστερασών PDE και ιοντικών διαύλων. Οι βασικές λειτουργίες του στο καρδιαγγειακό σύστημα συνιστούν η αγγειοδιαστολή, η αναστολή του πολλαπλασιασμού των λείων μυϊκών κυττάρων, η αντιθρομβωτική και αντιφλεγμονώδη δράση.
Η δυσλειτουργία του άξονα συσχετίζεται με παθοφυσιολογικές καταστάσεις του καρδιαγγειακού, όπως η υπέρταση, η αθηροσκλήρωση και η καρδιακή ανεπάρκεια. Το γεγονός αυτό απορρέει είτε από μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα του ΝΟ είτε από οξειδωτικό στρες με επακόλουθο την οξείδωση της αίμης και την αποικοδόμηση του ενζύμου από το πρωτεάσωμα. Οι δότες ΝΟ και οι αναστολείς PDE-5 χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση των επιπέδων ΝΟ και cGMP, αντίστοιχα, με περιορισμούς όμως κατά τη χρήση τους. Η sGC συνιστά φαρμακολογικό στόχο αγωνιστών του ενζύμου, με δράση ανεξάρτητη του ΝΟ. Οι sGC «διεγέρτες» έχουν αιμο-εξαρτώμενο μηχανισμό και παρουσιάζουν ισχυρή συνέργεια με το ενδογενές ΝΟ. Αντίθετα, οι sGC «ενεργοποιητές» έχουν αιμο-ανεξάρτητο μηχανισμό, αντικαθιστούν την οξειδωμένη αίμη και αποτρέπουν την αποικοδόμηση του ενζύμου.
Ο στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτελεί ο φαρμακολογικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός γνωστών και νέων υποψήφιων sGC αγωνιστών, που έχουν συντεθεί μέσω ορθολογικού σχεδιασμού και η πρόσδεση τους μελετάται στο βακτηριακό H-NOX μοντέλο του κυανοβακτηρίου Nostoc sp.
Ο φαρμακολογικός μηχανισμός δράσης των ενώσεων μελετήθηκε in vitro σε κυτταρικές καλλιέργειες LnCaP επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων και A7r5 λείων μυϊκών κυττάρων (RAoSM) με ανοσοδοκιμασία ELISA για μέτρηση των παραγόμενων επιπέδων cGMP και τεχνική κατά Western για την ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης VASP(Ser239). Η λειτουργική αξιολόγηση των ενώσεων πραγματοποιήθηκε σε δύο κυτταρικούς πληθυσμούς. Η επίδραση τους στον πολλαπλασιασμό των A7r5 λείων μυϊκών κυττάρων αξιολογήθηκε με δοκιμασία MTT. Η μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης πραγματοποιήθηκε σε πρωτογενή HUVEC ενδοθηλιακά κύτταρα για α) την ανίχνευση των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και P/E Selectin στην επιφάνεια τους με ανοσοδοκιμασία ELISA και β) τη μέτρηση, μέσω φθορισμού, της προσκόλλησης *U-937 λευκοκυττάρων, έπειτα από προλεγμονώδη διέγερση.
Οι νέοι συντεθειμένοι υποψήφιοι sGC ενεργοποιητές δεν έχουν τη χαρακτηριστική δράση της κατηγορίας καθώς δεν αυξάνουν τα επίπεδα cGMP σε συνθήκες οξειδωμένης αίμης και δεν ενισχύουν τη δράση του ΝΟ. Επιπλέον, δε λειτουργούν ως ανταγωνιστές της δράσης γνωστών ενεργοποιητών στο ένζυμο.
Οι δύο ισχυροί sGC ενεργοποιητές BAY 58-2667 και BAY 60-2770 έχουν διαφορετική ευαισθησία σε επαναγωγή της οξειδωμένη αίμης, προκαλούμενη από το αντιοξειδωτικό ασκορβικό οξύ. Κατά την παρουσία του, μειώνεται με χρονοευαίσθητο τρόπο η δράση του BAY 60-2770 αλλά δεν επηρεάζεται η δράση του BAY 58-2667.
Οι νέοι συντεθειμένοι υποψήφιοι sGC διεγέρτες προκαλούν ενίσχυση της δράσης του δότη ΝΟ SNP χωρίς όμως να έχουν από μόνες τους δράση ως προς την παραγωγή cGMP. Οι δράσεις αυτές είναι ευαίσθητες σε συνθήκες οξείδωσης, γεγονός που ταυτοποιεί τις ενώσεις ως διεγέρτες. Επιπλέον, υποκατάσταση σε συγκεκριμένη θέση της δομής τους επηρεάζει την ικανότητα ενίσχυσης της δράσης του SNP. Ανάλογα αποτελέσματα προκύπτουν ως προς τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης VASP (Ser239), όπου οι ενώσεις έχουν από κι από μόνες τους ασθενή δράση.
Η κυτταρική επίδραση των νέων sGC διεγερτών είναι ανάλογη με τις αντίστοιχα αποτελέσματα του SNP και του sGC διεγέρτη BAY 41-2272. Η ένωση DPK-382 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων και η ένωση DPK-384 ελαττώνει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και P/E Selectin στην επιφάνεια των HUVEC σε απόκριση στις κυτταροκίνες TNFα και IL-1β. Το γεγονός αυτό συσχετίζεται με μείωση της αποκρισιμότητας των HUVEC στις κυτταροκίνες κατά την προσκόλληση *U-937 λευκοκυττάρων.
Συνοπτικά, στην παρούσα διπλωματική εργασία επιτεύχθηκε η ταυτοποίηση και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός νέων συντεθειμένων ενώσεων ως sGC διεγερτών. Επιπλέον, σε αντίθεση με τα μέχρι τώρα δεδομένα ως προς την “σταθερή” και “μη αναστρέψιμη” πρόσδεση ενεργοποιητών στο ένζυμο, προκύπτει, για πρώτη φορά, πως δύο ισχυροί sGC ενεργοποιητές έχουν, παρά τις παρόμοιες τους χημικές δομές, διαφορετική ευαισθησία σε επαναγωγή της οξειδωμένης αίμης, γεγονός που εξαρτάται από την οξειδοαναγωγική της ισορροπία.
|
|---|
