Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε αγγειακά κύτταρα in vitro

Το μονοπάτι ΝΟ-sGC-cGMP διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε φυσιολογικές λειτουργίες του καρδιαγγειακού – και όχι μόνο – συστήματος. Το ένζυμο της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης sGC είναι ετεροδιμερής α/β αιμοπρωτεΐνη, με επικρατέστερη την α1β1 ισομορφή της. Η ρυθμιστική περιοχή της β1 υπομονάδας περιέχε...

Πλήρης περιγραφή

Λεπτομέρειες βιβλιογραφικής εγγραφής
Κύριος συγγραφέας:	Σαλαγιάννης, Κωνσταντίνος
Άλλοι συγγραφείς:	Salagiannis, Konstantinos
Γλώσσα:	Greek
Έκδοση:	2022
Θέματα:	Διαλυτή γουανυλική κυκλάση (sGC) Λεία μυϊκά κύτταρα Ενδοθηλιακά κύτταρα Αγωνιστές Αίμη Οξειδοαναγωγή Soluble guanylate cyclase (sGC) Smooth muscle cells Endothelial cells Agonists Heme Redox
Διαθέσιμο Online:	https://hdl.handle.net/10889/23953

id	nemertes-10889-23953
record_format	dspace
institution	UPatras
collection	Nemertes
language	Greek
topic	Διαλυτή γουανυλική κυκλάση (sGC) Λεία μυϊκά κύτταρα Ενδοθηλιακά κύτταρα Αγωνιστές Αίμη Οξειδοαναγωγή Soluble guanylate cyclase (sGC) Smooth muscle cells Endothelial cells Agonists Heme Redox
spellingShingle	Διαλυτή γουανυλική κυκλάση (sGC) Λεία μυϊκά κύτταρα Ενδοθηλιακά κύτταρα Αγωνιστές Αίμη Οξειδοαναγωγή Soluble guanylate cyclase (sGC) Smooth muscle cells Endothelial cells Agonists Heme Redox Σαλαγιάννης, Κωνσταντίνος Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε αγγειακά κύτταρα in vitro
description	Το μονοπάτι ΝΟ-sGC-cGMP διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε φυσιολογικές λειτουργίες του καρδιαγγειακού – και όχι μόνο – συστήματος. Το ένζυμο της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης sGC είναι ετεροδιμερής α/β αιμοπρωτεΐνη, με επικρατέστερη την α1β1 ισομορφή της. Η ρυθμιστική περιοχή της β1 υπομονάδας περιέχει την αίμη στην H-NOX κοιλότητα της. Η πρόσδεση του ΝΟ στην H-NOX οδηγεί στην παραγωγή της κυκλικής μονοφωσφορικής γουανοσίνης (cGMP) μέσω της 5’ τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP) από την καταλυτική περιοχή του ενζύμου. Το αγγελιαφόρο μόριο cGMP επιτελεί τη δράση του με ενεργοποίηση καθοδικών μονοπατιών της πρωτεϊνικής κινάσης PKG, των φωσφοδιεστερασών PDE και ιοντικών διαύλων. Οι βασικές λειτουργίες του στο καρδιαγγειακό σύστημα συνιστούν η αγγειοδιαστολή, η αναστολή του πολλαπλασιασμού των λείων μυϊκών κυττάρων, η αντιθρομβωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Η δυσλειτουργία του άξονα συσχετίζεται με παθοφυσιολογικές καταστάσεις του καρδιαγγειακού, όπως η υπέρταση, η αθηροσκλήρωση και η καρδιακή ανεπάρκεια. Το γεγονός αυτό απορρέει είτε από μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα του ΝΟ είτε από οξειδωτικό στρες με επακόλουθο την οξείδωση της αίμης και την αποικοδόμηση του ενζύμου από το πρωτεάσωμα. Οι δότες ΝΟ και οι αναστολείς PDE-5 χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση των επιπέδων ΝΟ και cGMP, αντίστοιχα, με περιορισμούς όμως κατά τη χρήση τους. Η sGC συνιστά φαρμακολογικό στόχο αγωνιστών του ενζύμου, με δράση ανεξάρτητη του ΝΟ. Οι sGC «διεγέρτες» έχουν αιμο-εξαρτώμενο μηχανισμό και παρουσιάζουν ισχυρή συνέργεια με το ενδογενές ΝΟ. Αντίθετα, οι sGC «ενεργοποιητές» έχουν αιμο-ανεξάρτητο μηχανισμό, αντικαθιστούν την οξειδωμένη αίμη και αποτρέπουν την αποικοδόμηση του ενζύμου. Ο στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτελεί ο φαρμακολογικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός γνωστών και νέων υποψήφιων sGC αγωνιστών, που έχουν συντεθεί μέσω ορθολογικού σχεδιασμού και η πρόσδεση τους μελετάται στο βακτηριακό H-NOX μοντέλο του κυανοβακτηρίου Nostoc sp. Ο φαρμακολογικός μηχανισμός δράσης των ενώσεων μελετήθηκε in vitro σε κυτταρικές καλλιέργειες LnCaP επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων και A7r5 λείων μυϊκών κυττάρων (RAoSM) με ανοσοδοκιμασία ELISA για μέτρηση των παραγόμενων επιπέδων cGMP και τεχνική κατά Western για την ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης VASP(Ser239). Η λειτουργική αξιολόγηση των ενώσεων πραγματοποιήθηκε σε δύο κυτταρικούς πληθυσμούς. Η επίδραση τους στον πολλαπλασιασμό των A7r5 λείων μυϊκών κυττάρων αξιολογήθηκε με δοκιμασία MTT. Η μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης πραγματοποιήθηκε σε πρωτογενή HUVEC ενδοθηλιακά κύτταρα για α) την ανίχνευση των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και P/E Selectin στην επιφάνεια τους με ανοσοδοκιμασία ELISA και β) τη μέτρηση, μέσω φθορισμού, της προσκόλλησης U-937 λευκοκυττάρων, έπειτα από προλεγμονώδη διέγερση. Οι νέοι συντεθειμένοι υποψήφιοι sGC ενεργοποιητές δεν έχουν τη χαρακτηριστική δράση της κατηγορίας καθώς δεν αυξάνουν τα επίπεδα cGMP σε συνθήκες οξειδωμένης αίμης και δεν ενισχύουν τη δράση του ΝΟ. Επιπλέον, δε λειτουργούν ως ανταγωνιστές της δράσης γνωστών ενεργοποιητών στο ένζυμο. Οι δύο ισχυροί sGC ενεργοποιητές BAY 58-2667 και BAY 60-2770 έχουν διαφορετική ευαισθησία σε επαναγωγή της οξειδωμένη αίμης, προκαλούμενη από το αντιοξειδωτικό ασκορβικό οξύ. Κατά την παρουσία του, μειώνεται με χρονοευαίσθητο τρόπο η δράση του BAY 60-2770 αλλά δεν επηρεάζεται η δράση του BAY 58-2667. Οι νέοι συντεθειμένοι υποψήφιοι sGC διεγέρτες προκαλούν ενίσχυση της δράσης του δότη ΝΟ SNP χωρίς όμως να έχουν από μόνες τους δράση ως προς την παραγωγή cGMP. Οι δράσεις αυτές είναι ευαίσθητες σε συνθήκες οξείδωσης, γεγονός που ταυτοποιεί τις ενώσεις ως διεγέρτες. Επιπλέον, υποκατάσταση σε συγκεκριμένη θέση της δομής τους επηρεάζει την ικανότητα ενίσχυσης της δράσης του SNP. Ανάλογα αποτελέσματα προκύπτουν ως προς τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης VASP (Ser239), όπου οι ενώσεις έχουν από κι από μόνες τους ασθενή δράση. Η κυτταρική επίδραση των νέων sGC διεγερτών είναι ανάλογη με τις αντίστοιχα αποτελέσματα του SNP και του sGC διεγέρτη BAY 41-2272. Η ένωση DPK-382 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων και η ένωση DPK-384 ελαττώνει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και P/E Selectin στην επιφάνεια των HUVEC σε απόκριση στις κυτταροκίνες TNFα και IL-1β. Το γεγονός αυτό συσχετίζεται με μείωση της αποκρισιμότητας των HUVEC στις κυτταροκίνες κατά την προσκόλληση U-937 λευκοκυττάρων. Συνοπτικά, στην παρούσα διπλωματική εργασία επιτεύχθηκε η ταυτοποίηση και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός νέων συντεθειμένων ενώσεων ως sGC διεγερτών. Επιπλέον, σε αντίθεση με τα μέχρι τώρα δεδομένα ως προς την “σταθερή” και “μη αναστρέψιμη” πρόσδεση ενεργοποιητών στο ένζυμο, προκύπτει, για πρώτη φορά, πως δύο ισχυροί sGC ενεργοποιητές έχουν, παρά τις παρόμοιες τους χημικές δομές, διαφορετική ευαισθησία σε επαναγωγή της οξειδωμένης αίμης, γεγονός που εξαρτάται από την οξειδοαναγωγική της ισορροπία.
author2	Salagiannis, Konstantinos
author_facet	Salagiannis, Konstantinos Σαλαγιάννης, Κωνσταντίνος
author	Σαλαγιάννης, Κωνσταντίνος
author_sort	Σαλαγιάννης, Κωνσταντίνος
title	Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε αγγειακά κύτταρα in vitro
title_short	Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε αγγειακά κύτταρα in vitro
title_full	Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε αγγειακά κύτταρα in vitro
title_fullStr	Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε αγγειακά κύτταρα in vitro
title_full_unstemmed	Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε αγγειακά κύτταρα in vitro
title_sort	φαρμακολογικός χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε αγγειακά κύτταρα in vitro
publishDate	2022
url	https://hdl.handle.net/10889/23953
work_keys_str_mv	AT salagiannēskōnstantinos pharmakologikoscharaktērismosneōnagōnistōntēsdialytēsgouanylikēskyklasēsseangeiakakyttarainvitro AT salagiannēskōnstantinos pharmacologicalcharacterizationofnovelsolubleguanylatecyclaseagonistsinvascularcellsinvitro
_version_	1771297169053057024
spelling	nemertes-10889-239532022-11-16T04:34:45Z Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε αγγειακά κύτταρα in vitro Pharmacological characterization of novel soluble guanylate cyclase agonists in vascular cells in vitro Σαλαγιάννης, Κωνσταντίνος Salagiannis, Konstantinos Διαλυτή γουανυλική κυκλάση (sGC) Λεία μυϊκά κύτταρα Ενδοθηλιακά κύτταρα Αγωνιστές Αίμη Οξειδοαναγωγή Soluble guanylate cyclase (sGC) Smooth muscle cells Endothelial cells Agonists Heme Redox Το μονοπάτι ΝΟ-sGC-cGMP διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε φυσιολογικές λειτουργίες του καρδιαγγειακού – και όχι μόνο – συστήματος. Το ένζυμο της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης sGC είναι ετεροδιμερής α/β αιμοπρωτεΐνη, με επικρατέστερη την α1β1 ισομορφή της. Η ρυθμιστική περιοχή της β1 υπομονάδας περιέχει την αίμη στην H-NOX κοιλότητα της. Η πρόσδεση του ΝΟ στην H-NOX οδηγεί στην παραγωγή της κυκλικής μονοφωσφορικής γουανοσίνης (cGMP) μέσω της 5’ τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP) από την καταλυτική περιοχή του ενζύμου. Το αγγελιαφόρο μόριο cGMP επιτελεί τη δράση του με ενεργοποίηση καθοδικών μονοπατιών της πρωτεϊνικής κινάσης PKG, των φωσφοδιεστερασών PDE και ιοντικών διαύλων. Οι βασικές λειτουργίες του στο καρδιαγγειακό σύστημα συνιστούν η αγγειοδιαστολή, η αναστολή του πολλαπλασιασμού των λείων μυϊκών κυττάρων, η αντιθρομβωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Η δυσλειτουργία του άξονα συσχετίζεται με παθοφυσιολογικές καταστάσεις του καρδιαγγειακού, όπως η υπέρταση, η αθηροσκλήρωση και η καρδιακή ανεπάρκεια. Το γεγονός αυτό απορρέει είτε από μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα του ΝΟ είτε από οξειδωτικό στρες με επακόλουθο την οξείδωση της αίμης και την αποικοδόμηση του ενζύμου από το πρωτεάσωμα. Οι δότες ΝΟ και οι αναστολείς PDE-5 χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση των επιπέδων ΝΟ και cGMP, αντίστοιχα, με περιορισμούς όμως κατά τη χρήση τους. Η sGC συνιστά φαρμακολογικό στόχο αγωνιστών του ενζύμου, με δράση ανεξάρτητη του ΝΟ. Οι sGC «διεγέρτες» έχουν αιμο-εξαρτώμενο μηχανισμό και παρουσιάζουν ισχυρή συνέργεια με το ενδογενές ΝΟ. Αντίθετα, οι sGC «ενεργοποιητές» έχουν αιμο-ανεξάρτητο μηχανισμό, αντικαθιστούν την οξειδωμένη αίμη και αποτρέπουν την αποικοδόμηση του ενζύμου. Ο στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτελεί ο φαρμακολογικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός γνωστών και νέων υποψήφιων sGC αγωνιστών, που έχουν συντεθεί μέσω ορθολογικού σχεδιασμού και η πρόσδεση τους μελετάται στο βακτηριακό H-NOX μοντέλο του κυανοβακτηρίου Nostoc sp. Ο φαρμακολογικός μηχανισμός δράσης των ενώσεων μελετήθηκε in vitro σε κυτταρικές καλλιέργειες LnCaP επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων και A7r5 λείων μυϊκών κυττάρων (RAoSM) με ανοσοδοκιμασία ELISA για μέτρηση των παραγόμενων επιπέδων cGMP και τεχνική κατά Western για την ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης VASP(Ser239). Η λειτουργική αξιολόγηση των ενώσεων πραγματοποιήθηκε σε δύο κυτταρικούς πληθυσμούς. Η επίδραση τους στον πολλαπλασιασμό των A7r5 λείων μυϊκών κυττάρων αξιολογήθηκε με δοκιμασία MTT. Η μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης πραγματοποιήθηκε σε πρωτογενή HUVEC ενδοθηλιακά κύτταρα για α) την ανίχνευση των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και P/E Selectin στην επιφάνεια τους με ανοσοδοκιμασία ELISA και β) τη μέτρηση, μέσω φθορισμού, της προσκόλλησης U-937 λευκοκυττάρων, έπειτα από προλεγμονώδη διέγερση. Οι νέοι συντεθειμένοι υποψήφιοι sGC ενεργοποιητές δεν έχουν τη χαρακτηριστική δράση της κατηγορίας καθώς δεν αυξάνουν τα επίπεδα cGMP σε συνθήκες οξειδωμένης αίμης και δεν ενισχύουν τη δράση του ΝΟ. Επιπλέον, δε λειτουργούν ως ανταγωνιστές της δράσης γνωστών ενεργοποιητών στο ένζυμο. Οι δύο ισχυροί sGC ενεργοποιητές BAY 58-2667 και BAY 60-2770 έχουν διαφορετική ευαισθησία σε επαναγωγή της οξειδωμένη αίμης, προκαλούμενη από το αντιοξειδωτικό ασκορβικό οξύ. Κατά την παρουσία του, μειώνεται με χρονοευαίσθητο τρόπο η δράση του BAY 60-2770 αλλά δεν επηρεάζεται η δράση του BAY 58-2667. Οι νέοι συντεθειμένοι υποψήφιοι sGC διεγέρτες προκαλούν ενίσχυση της δράσης του δότη ΝΟ SNP χωρίς όμως να έχουν από μόνες τους δράση ως προς την παραγωγή cGMP. Οι δράσεις αυτές είναι ευαίσθητες σε συνθήκες οξείδωσης, γεγονός που ταυτοποιεί τις ενώσεις ως διεγέρτες. Επιπλέον, υποκατάσταση σε συγκεκριμένη θέση της δομής τους επηρεάζει την ικανότητα ενίσχυσης της δράσης του SNP. Ανάλογα αποτελέσματα προκύπτουν ως προς τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης VASP (Ser239), όπου οι ενώσεις έχουν από κι από μόνες τους ασθενή δράση. Η κυτταρική επίδραση των νέων sGC διεγερτών είναι ανάλογη με τις αντίστοιχα αποτελέσματα του SNP και του sGC διεγέρτη BAY 41-2272. Η ένωση DPK-382 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων και η ένωση DPK-384 ελαττώνει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και P/E Selectin στην επιφάνεια των HUVEC σε απόκριση στις κυτταροκίνες TNFα και IL-1β. Το γεγονός αυτό συσχετίζεται με μείωση της αποκρισιμότητας των HUVEC στις κυτταροκίνες κατά την προσκόλληση U-937 λευκοκυττάρων. Συνοπτικά, στην παρούσα διπλωματική εργασία επιτεύχθηκε η ταυτοποίηση και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός νέων συντεθειμένων ενώσεων ως sGC διεγερτών. Επιπλέον, σε αντίθεση με τα μέχρι τώρα δεδομένα ως προς την “σταθερή” και “μη αναστρέψιμη” πρόσδεση ενεργοποιητών στο ένζυμο, προκύπτει, για πρώτη φορά, πως δύο ισχυροί sGC ενεργοποιητές έχουν, παρά τις παρόμοιες τους χημικές δομές, διαφορετική ευαισθησία σε επαναγωγή της οξειδωμένης αίμης, γεγονός που εξαρτάται από την οξειδοαναγωγική της ισορροπία. The NO-sGC-cGMP pathway has a pivotal role in normal functions of the cardiovascular - and not only - system. The enzyme of soluble guanylate cyclase sGC is a heterodimeric α/β hemoprotein, with its α1/β1 isoform predominating. The regulatory region of the β1 subunit incorporates the heme at the H-NOX domain. The binding of NO at the same domain, leads to the production of cyclic guanosine monophosphate cGMP from 5’ guanosine triphosphate (GTP) through the enzyme’s catalytic region. The second messenger cGMP molecule performs its action by activating the downstream pathways of PKG protein kinase, PDE phosphodiesterases and ion channels. The main cardiovascular functions of cGMP include vasodilation, inhibition of smooth muscle cell proliferation, anticoagulant and anti-inflammatory action. A dysfunctional axis is associated with cardiovascular pathophysiological conditions such as hypertension, atherosclerosis and heart failure, caused by either reduced NO bioavailability or oxidative stress resulting in heme oxidation and proteasomal degradation of the enzyme. NO donors and PDE-5 inhibitors are used to enhance NO and cGMP levels, respectively, but exhibit limitations in their use. The sGC enzyme is a pharmacological target for its agonists, acting independently of NO. The sGC “stimulators” possess a heme-dependent mechanism of action and show strong synergy with endogenous NO. In contrast, the heme-independent sGC “activators” replace the oxidized heme and prevent enzyme degradation. The aim of the present dissertation is the pharmacological and functional characterization of known and new candidate sGC agonists, synthesized by a rational design process and evaluated in terms of their binding mode at the bacterial H-NOX model of cyanobacterium Nostoc sp. The pharmacological mechanism of action was studied in vitro at LnCaP prostate cancer epithelial cells and A7r5 rat aortic smooth muscle cells (RAoSM) by a cell-based ELISA immunoassay for the measurement of cGMP levels and by Western blotting for the detection of VASP (Ser239) protein phosphorylation. The functional characterization of the compounds was performed at two different cell models. The effect on the proliferation of A7r5 smooth muscle cells was evaluated by MTT assay. The evaluation of their anti-inflammatory activity was studied at primary HUVEC endothelial cells for a) the detection of ICAM-1 and P/E Selectin cell surface adhesion molecules by ELISA immunoassay and b) the fluorescence measurement of U-937 leukocytes adhesion on them, after proinflammatory stimulation. The newly synthesized candidate sGC activators do not possess the characteristic action of their respective class since they do not increase cGMP levels under heme oxidation and do not enhance the effect of NO. Moreover, they do not inhibit the effect of known sGC activators. The activity of two potent sGC activators is affected differently by altering the heme’s oxidative state. The re-reduction of the oxidized heme, caused by L-ascorbate, decreases the effect of BAY 60-2770 in a time-sensitive manner, while it does not alter the effect of BAY 58-2667. The newly synthesized candidate sGC stimulators potentiate the activity of the NO donor SNP but have no effect on their own in terms of cGMP production. The above effects are sensitive to heme oxidation, which identifies the compounds as stimulators of the enzyme. In addition, substitutions at a specific position of their structure affects the ability to enhance the effect of SNP. Similar results are obtained in terms of phosphorylation of VASP (Ser239) protein phosphorylation, where the compounds possess a weak effect on their own. The cellular effect of the new sGC stimulators is similar to the respective effects of SNP and sGC stimulator BAY 41-2272. The compound DPK-382 reduces smooth muscle cell proliferation while the compound DPK-384 reduces the expression of ICAM-1 and P/E Selectin cell-surface adhesion molecules in response to cytokines TNFα and IL-1β. The latter effect seems to be associated with a reduced responsiveness of HUVECs to the cytokines during the adhesion of U-937 leukocytes. Overall, the results of the present dissertation achieved the identification and functional characterization of new structures as sGC stimulators. Moreover, in contrary to previous data regarding the “irreversible” and “rather stable” binding of activators to the enzyme, we show, for the first time, that two potent sGC activators show, despite their similar chemical structures, different sensitivity to heme re-reduction, which is affected by its redox state. 2022-11-15T08:07:41Z 2022-11-15T08:07:41Z 2021-11-23 https://hdl.handle.net/10889/23953 gr application/pdf

Φαρμακολογικός χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε αγγειακά κύτταρα in vitro

Παρόμοια τεκμήρια