Εύρεση του δικτύου πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της αντιτοξίνης MqsA της Escherichia coli

• Κύριος συγγραφέας: Κτενά, Ειρήνη
• Άλλοι συγγραφείς: Ktena, Eirini
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2022
• Θέματα: Οπερόνιο τοξίνης-αντιτοξίνης; Βιοϋμένια; MqsA; MqsR; Biofilms

Όλα τα βακτήρια περιέχουν γονίδια που κωδικοποιούν συστήματα τοξινών-αντιτοξινών (ΤΑ), που τους επιτρέπουν να επιβιώνουν σε συνθήκες στρες (οξειδωτικό, ωσμωτικό, αντιβιοτικά κλπ). Το πιο συχνά επαγόμενο σύστημα ΤΑ του βακτηρίου Escherichia coli, είναι το σύστημα MqsR-MqsA. Το γονίδιο mqsR κωδικοποιεί τη τοξίνη MqsR (ενδοριβονουκλεάση), η οποία προκαλεί αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης επηρεάζοντας τον μεταβολισμό των κυττάρων. Το γονίδιο mqsA, κωδικοποιεί την αντιτοξίνη MqsA, η οποία κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, δεσμεύεται σταθερά στην MqsR και εξουδετερώνει την ενεργότητά της. Τα δύο γονίδια αποτελούν ένα οπερόνιο το οποίο καταστέλλεται μεταγραφικώς από το σύμπλοκο MqsR-MqsA. Σε συνθήκες στρες αποδομείται η MqsA, ελευθερώνεται η ΜqsR, αναστέλλεται ο μεταβολισμός και ενδέχεται να δημιουργηθούν βιοϋμένια με ανθεκτικές μορφές βακτηρίων (persisters). Σκοπός της μεταπτυχιακής διατριβής είναι η περαιτέρω εξέταση του βιολογικού ρόλου των πρωτεϊνών MqsA και ΜqsR. Αρχικά πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση και απομόνωση των πρωτεϊνών από καλλιέργειες Escherichia coli μετασχηματισμένες με τα σχετικά πλασμίδια. Η απομόνωση της ΜqsR έγινε με μεταλλοχηλική χρωματογραφία σε στήλη νικελίου ενώ η απομόνωση της MqsA έγινε με ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία. Για τον τελικό καθαρισμό και των δύο πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε η χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Σε αντίθεση με την MqsR, η οποία δεν καθαρίστηκε σε ικανοποιητικό βαθμό, η απομονωμένη πρωτεΐνη MqsA ακινητοποιήθηκε σε στήλη Affi-Gel 10 στην οποία χρωματογραφήθηκαν εκχυλίσματα βακτηριακών κυττάρων από την εκθετική και στατική φάση ανάπτυξής τους. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με αυξανόμενη ιοντική ισχύ (ιοντικές αλληλεπιδράσεις), οξύ (υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις) και διθειοθρεϊτόλη (δισουλφιδικοί δεσμοί) και ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας. Ακολούθησε στατιστική και βιοπληροφορική ανάλυση των αποτελεσμάτων με τις λογισμικές πλατφόρμες Perseus και Cytoscape ώστε να κατασκευαστεί το δίκτυο των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της MqsA.