Χρήση εμφυτευμάτων τύπου υδροπηκτής και μικροσφαιρών για την ελεγχόμενη χορήγηση βιοδραστικών πρωτεϊνικών μορίων

• Κύριος συγγραφέας: Μουίκης, Ανδρέας
• Άλλοι συγγραφείς: Mouikis, Andreas
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2023
• Θέματα: Βιοδιασπώμενες μικροσφαίρες; Βιοδιασπώμενες υδροπηκτές; Ελεγχόμενη χορήγηση βιοδραστικών πρωτεΐνων; Biodegradable microspheres; Biodegradable hydrogels; Controlled administration of bioactive proteins

Οι πρωτεΐνες είναι οργανικά μόρια που παράγονται στα ριβοσώματα των κυττάρων και είναι υπεύθυνες για διαφορετικές λειτουργίες στους ζωντανούς οργανισμούς όπως είναι η ρύθμιση των επιπέδων της γλυκόζης στο αίμα και την ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος. Οπότε είναι λογικό αυτού του είδους βιοδραστικές πρωτεΐνες να παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρουν για την δημιουργία φαρμάκων για την καταπολέμηση ασθενειών που επηρεάζουν το ανθρώπινο σώμα. Το πρώτο βήμα για την παραγωγή αυτόν των σκευασμάτων ήταν η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA, επιτρέποντας έτσι την παραγωγή τους σε προκαρυωτικούς οργανισμούς με αποτέλεσμα να αυξηθεί τόσο η διαθεσιμότητα όσο και η καθαρότητα του τελικού προϊόντος. Ωστόσο παρά τις πολλαπλές επιτυχίες των θεραπευτικών πρωτεϊνών, με μεγαλύτερο παράδειγμα την ινσουλίνη, υπάρχουν ακόμα εμπόδια όσον αφορά την χρήση τους με το μεγαλύτερο να είναι η σταθερότητά τους στην κυκλοφορία του αίματος καθώς απομακρύνονται από τη κυκλοφορία με ταχέος ρυθμούς οδηγώντας όχι μόνο σε μειωμένη φαρμακευτική δράση αλλά και σε πολλαπλές χορηγήσεις της πρωτεΐνης. Για αυτόν το λόγο οι ερευνητές προσπαθούν να δημιουργήσουν φαρμακευτικά συστήματα χορήγησης, από βιοδιασπώμενα πολυμερή, που θα προστατεύουν τις θεραπευτικές πρωτεΐνες και θα επιτρέπουν την σταθερή απελευθέρωσή της στην κυκλοφορία έτσι ώστε να επιτευχθεί η θεραπευτική του λειτουργία. Τα βιοδιασπώμενα πολυμερή είναι μόρια τα οποία είναι ικανά να διασπαστούν από τον οργανισμό με το τελικό προϊόν που παράγεται να μην είναι τοξικό ως προς τον οργανισμό. Τα πολυμερή τα οποία χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή την εργασία είναι το πολυ(γαλακτικό-γλυκολικό) οξύ (PLGA), το πολυγαλακτικό οξύ (PLA) και η χιτοζάνη. Δύο συνθέσεις PLGA συμπολυμερών συμπεριλήφθηκαν στην μελέτη: PLGA(85:15) και PLGA (75:25). Τα πολυμερή PLGA και PLA χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή μικροσφαιρών με εγκλεισμένη πρωτεΐνη (αλβουμίνη, ιντερφερόνη αλφα-2α, ή ιντερλευκίνη-2) με την μέθοδο γαλακτωματοποίησης και εξάτμισης του διαλύτη. Η απόδοση παρασκευής των μικροσφαιρών ήταν πολύ υψηλή (> 99%). Το μέγεθος των μικροσφαιρών προσδιορίστηκε από εικόνες που λήφθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) με την χρήση του προγράμματος ImageJ και η μέση διάμετρος των μικροσφαιρών ήταν 2,4 μm. Η ποσότητα πρωτεΐνης που εγκλείσθηκε στις μικροσφαίρες (ενκαψακίωση) προσδιορίστηκε με BCA. Η ενκαψακίωση αλβουμίνης ήταν υψηλή (> 80%) μόνο στην περίπτωση των PLGA συμπολυμερών, οπότε αποφασίστηκε με τις άλλες δύο πρωτεΐνες να παρασκευαστούν μικροσφαίρες από αυτά μόνο τα πολυμερή. Η ενκαψακίωση της ιντερφερόνης αλφα-2α ήταν 80 ± 0,03% και 50 ± 1,04% για το PLGA (85:15) και το PLGA (75:25), αντίστοιχα. Η ενκαψακίωση της ιντερλευκίνης-2 στις μικροσφαίρες PLGA (85:15) ήταν 81 ± 0,54. Η αποδέσμευση της αλβουμίνης από τις μικροσφαίρες ήταν αργή (παρατεταμένη) με όλα τα πολυμερή που δοκιμάστηκαν. Διαπιστώθηκε ότι τόσο η ταχεία αρχική αποδέσμευση (burst release) όσο και η συνολική αποδέσμευση της αλβουμίνης επηρεάζεται από τον τύπο του πολυμερούς που χρησιμοποιείται για την παρασκευή των μικροσφαιρών. Η αποδέσμευση της ιντερφερόνης-αλφα-2α και της ιντερλευκίνης-2 από τις μικροσφαίρες PLGA ήταν ελάχιστη αλλά μπορούσε να αυξηθεί σημαντικά αν ενσωματώνονταν στις μικροσφαίρες η υδρόφιλη πολυ(αιθυλενογλυκόλη) (PEG) σε αναλογία 1:1 κατά βάρος με το PLGA πολυμερές. Η δομική ακεραιότητα της απελευθερούμενης από τις μικροσφαίρες πρωτεΐνης εξετάστηκε με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (SEC-HPLC) και με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Τα αποτελέσματα της χρωματογραφίας υποδεικνύουν ότι οι πρωτεΐνες ιντερφερόνη-αλφα-2α και της ιντερλευκίνη-2 διατηρούν την δομική τους ακεραιότητα μετά τον εγκλωβισμό τους στις μικροσφαίρες. Τα αποτελέσματα της χρωματογραφίας επιβεβαιώθηκαν από τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης. Εκτός από τις μικροσφαίρες αναπτύχθηκαν επίσης θερμοευαίσθητες υδροπηκτές (υδρογέλες, hydrogels) με βάση την χιτοζάνη που υφίστανται μετάπτωση από την υγρή (ρευστή) κατάσταση στην κατάσταση πηκτής (sol-gel transition) όταν ευρεθούν στην θερμοκρασία του σώματος (37 οC). Η χιτοζάνη είναι διαλυτή σε υδατικό περιβάλλον σε pH<6.2, όμως σχηματίζει μη-διαλυτά συσσωματώματα σε υψηλότερες τιμές pH. Η προσθήκη αλάτων πολυ-αλκοολών όπως το μετά νατρίου άλας της φωσφορικής-2-γλυκερόλης (GP) αποτρέπει τη συσσωμάτωση και αυξάνει την περιοχή pH στην οποία η χιτοζάνη διατηρεί την υδατοδιαλυτότητα της. Με βάση τα παραπάνω, φτιάχτηκαν διαλύματα χιτοζάνης/GP κατάλληλης αναλογίας ώστε να έχουν pH κοντά στο φυσιολογικό (7,4) και να μετατρέπονται ταχέως (σε λιγότερο από 3 λεπτά) σε gel όταν εκτεθούν σε θερμοκρασία σώματος (37 oC), ενώ να διατηρούνται με τη μορφή διαλύματος τουλάχιστον για 2 ώρες στην θερμοκρασία δωματίου (20 oC) και να μην υφίστανται την μετατροπή σε gel όταν αποθηκεύονται στο ψυγείο (4 oC). Τα διαλύματα αυτά είχαν συγκέντρωση χιτοζάνης μεταξύ 0,8% και 1% w/v και συγκέντρωση GP μεταξύ 10,1% και 12,4%, αντίστοιχα. H αποδέσμευση των πρωτεϊνών από την υδρογέλη χιτοζάνης ήταν παρατεταμένη, και με αύξηση της συγκέντρωσης της χιτοζάνης είχαμε ελάττωση του ρυθμού αποδέσμευσης της ιντερφερόνης. Με βάση τα αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης, η απελευθερούμενη από την υδρογέλη πρωτεΐνη διατηρούσε την δομική της ακεραιότητα. Στην εργασία αυτή αναπτύχθηκαν συστήματα παρατεταμένης αποδέσμευσης IFNα2α και IL-2 με την μορφή βιοαποικοδομήσιμων μικροσφαιρών και υδροπηκτών χιτοζάνης. Ο εγκλεισμός των πρωτεϊνων αυτών στις μικροσφαίρες ή στην υδροπηκτή δεν επηρέαζε αρνητικά την δομική ακεραιότητα τους. Η αποδέσμευση ήταν πολύ πιο αργή στην περίπτωση των μικροσφαιρών. Οι μικροσφαίρες θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν μετά από περαιτέρω μελέτη για την δημιουργία ενός συστήματος χορήγησης των πρωτεϊνών αυτών για μακρά χρονική περίοδο (πχ μία δόση τον μήνα) ενώ η μορφή της υδροπηκτής για την δημιουργία ενός συστήματος χορήγησης των πρωτεϊνών αυτών για μια σχετικά πιο σύντομη χρονική περίοδο (πχ μία δόση την εβδομάδα).