Ανάλυση με βιοπληροφορικά εργαλεία της πρωτεΐνης Castor και μελέτη της έκφρασης της και των μοριακών αλληλεπιδράσεων της σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

• Κύριος συγγραφέας: Πεφάνη, Ελευθερία Δάφνη
• Άλλοι συγγραφείς: Λυγερού, Ζωή
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2009
• Θέματα: Κυτταρικός κύκλος; Πρωτεΐνες; Cell cycle; Proteins; Geminin; Castor; 571.84

Η ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης είναι εξέχουσας σημασίας κατά την ανάπτυξη των πολυκύτταρων οργανισμών. Κεντρικοί ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου έχει δειχθεί να συμμετέχουν και σε διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης, όπως η οικογένεια των E2F μεταγραφικών παραγόντων, το pRb και οι αναστολείς των κυκλινοεξατώμενων κινασών (CKIs). H Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και στην ανάπτυξη, η οποία έχει προταθεί σαν ένας πιθανός ρυθμιστής αυτών των διαδικασιών. H Geminin εμφανίζει διαφορετικές δράσεις, αλληλεπιδρώντας με ένα σημαντικό αριθμό κυτταρικών παραγόντων. Σε αυτές τις αλληλεπιδράσεις σημαντικό ρόλο παίζει η περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin. Πρόσφατα, μέσω βιοπληροφορικών αναλύσεων βρέθηκε ένας γενετικός τόπος στο ανθρώπινο γονιδίωμα ο οποίος κωδικοποιεί για μία πρωτεϊνική αλληλουχία με σημαντική ομολογία με το σπειροειδές σπείραμα της Geminin. H πρωτεΐνη αυτή ονομάστηκε Castor. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν εργαλεία βιοπληροφορικής, για την ανάλυση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας του Castor και τη σύγκριση αυτής με την Geminin. Στη συνέχεια, μελετήθηκε με την μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Castor με τη Geminin και ο ομοδιμερισμός του Castor και χαρτογραφήθηκαν οι περιοχές που ευθύνονται για τις αλληλεπιδράσεις αυτές.. Ο Castor σχηματίζει σύμπλοκο με την Geminin και η αλληλεπίδραση αυτή απαιτεί το σπειροειδές σπείραμα της Geminin και τα 254 καρβοξυτελικά αμινοξέα του Castor, στα οποία περιέχεται το σπειροειδές σπείραμα του. Τα τελευταία 254 αμινοξέα είναι υπεύθυνα και για τον ομοδιμερισμό του μορίου. Σύγκριση της ισχύος αλληλεπιδράσεων έδειξε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ Castor και Geminin είναι ισχυρότερη από τον ομοδιμερισμό του Castor, αφού η Geminin δύναται να ανταγωνιστεί την πρόσδεση του Castor στον εαυτό του. Τέλος, αναπτύχθηκαν μοριακά εργαλεία απαραίτητα για τη μελέτη του Castor. To πρώτο αφορά την παραγωγή και καθαρισμό πολυκλωνικού αντισώματος κατά αμινοτελικού τμήματος της Castor πρωτεΐνης. Η ειδικότητα του αντισώματος ελέγχθηκε με ανοσοτύπωση Western. To αντίσωμα είναι λειτουργικό αφού αναγνωρίζει την εξωγενή πρωτεΐνη CastorGFP ενώ δεν μπορούν να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα για την ενδογενή ανθρώπινη πρωτεΐνη. Το δεύτερο αφορά την 7 ανάπτυξη της μεθοδολογίας RNAi για την αποσιώπηση του γονιδίου του Castor σε κυτταρικές σειρές. Η λειτουργικότητα του RNAi ελέγχθηκε τόσο σε ανοσοτύπωση Western όσο και σε ανοσοφθορισμό σε σταθερά διαμολυσμένη με CastorGFP κυτταρική σειρά και είναι λειτουργικό. Τα παραπάνω εργαλεία είναι απαραίτητα για μελλοντικές λειτουργικές μελέτες του Castor.