| Περίληψη: | Με την πάροδο των χρόνων έχει αποδειχθεί πως η συνεχής μελέτη, βελτίωση και παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών αποτελεί έναν από τους ακρογωνιαίους λίθους της σύγχρονης επιστημονικής κοινότητας. Η πρόοδος που έχει σημειωθεί στον συγκεκριμένο τομέα συνεισφέρει
στην εξέλιξη των βιοτεχνολογικών μεθόδων, της ιατρικής καθώς και στον δομικό προσδιορισμό των στόχων των φαρμάκων.
Για την παραγωγή των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται κατά κανόνα βακτηριακά συστήματα ως κύτταρα ξενιστές λόγω του χαμηλού τους κόστους και της απλότητας τους. Αυτό εφαρμόστηκε και στην παρούσα διπλωματική εργασία, όπου σχεδιάστηκε και μελετήθηκε η έκφραση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης, μίας όξινης γλυκοπρωτεϊνικής ορμόνης 165 αμινοξέων, σε συνθήκες εργαστηριακής κλίμακας καθώς και σε βιοαντιδραστήρα πάγκου. Για να μπορέσει να αξιοποιηθεί ο βιοαντιδαστήρας, χρειάστηκε να γίνει πρώτα ο έλεγχος απόδοσής του με μία καλά μελετημένη πρωτεΐνη, την Arkadia, η οποία εκφράστηκε και απομονώθηκε ώστε να συγκριθεί με την αντίστοιχη πρωτεΐνη προερχόμενη από τη συμβατική παραγωγή σε φλάσκα. Αφού ο έλεγχος υπήρξε ικανοποιητικός, ακολούθησε η παραγωγή της πρωτεΐνης ενδιαφέροντος.
Πιο συγκεκριμένα, το γονίδιο που εκφράζει την ερυθροποιητίνη εισήχθη σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα και στη συνέχεια το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μετασχηματίστηκε σε βακτηριακά κύτταρα E. coli . Η έκφραση της πρωτεΐνης ενδιαφέροντος ελέγθηκε σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές του εν λόγω βακτηρίου, τα κύτταρα E. cloni EXPRESS και τα Rosetta2(DE3)pLysS και συγκρίθηκε η απόδοση με τη χρήση φλάσκας και βιοαντιδραστήρα.
Μετά την ολοκλήρωση των πειραμάτων αποδείχθηκε ότι με την 1η κυτταρική σειρά επιτεύχθηκε καλύτερη απόδοση στην έκφραση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης (rhEPO). Ακολούθησε η προσπάθεια απομόνωσης της μέσω χρωματογραφίας συγγένειας. Η απόδοση της
παραγόμενης πρωτεΐνης ήταν αρκετά ικανοποιητική, ωστόσο δεν επιτεύχθηκε η απομόνωση της με υψηλή καθαρότητα. Αξίζει να αναφερθεί, επίσης, ότι παρατηρείται ισχυρότερη έκφραση του προϊόντος όταν αυτό προέρχεται από καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα, ωστόσο θα πρέπει να διερευνηθούν οι συνθήκες για την επίτευξη της απομόνωσης της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης και της εύρεσης του κατάλληλου διαλύματος, στο οποίο θα παραμένει σταθερή.
|
|---|
