Συστηματική μελέτη και βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μικρής κλίμακας βιοαντιδραστήρα
Με την πάροδο των χρόνων έχει αποδειχθεί πως η συνεχής μελέτη, βελτίωση και παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών αποτελεί έναν από τους ακρογωνιαίους λίθους της σύγχρονης επιστημονικής κοινότητας. Η πρόοδος που έχει σημειωθεί στον συγκεκριμένο τομέα συνεισφέρει στην εξέλιξη των βιοτεχνολογικών μεθόδων...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2023
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | https://hdl.handle.net/10889/24784 |
| id |
nemertes-10889-24784 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Ερυθροποιητίνη Βιοαντιδραστήρες Καλλιέργεια κυττάρων Erythropoietin Bioreactors Cell culture |
| spellingShingle |
Ερυθροποιητίνη Βιοαντιδραστήρες Καλλιέργεια κυττάρων Erythropoietin Bioreactors Cell culture Γιοβανάκη, Μυρτώ Συστηματική μελέτη και βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μικρής κλίμακας βιοαντιδραστήρα |
| description |
Με την πάροδο των χρόνων έχει αποδειχθεί πως η συνεχής μελέτη, βελτίωση και παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών αποτελεί έναν από τους ακρογωνιαίους λίθους της σύγχρονης επιστημονικής κοινότητας. Η πρόοδος που έχει σημειωθεί στον συγκεκριμένο τομέα συνεισφέρει
στην εξέλιξη των βιοτεχνολογικών μεθόδων, της ιατρικής καθώς και στον δομικό προσδιορισμό των στόχων των φαρμάκων.
Για την παραγωγή των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται κατά κανόνα βακτηριακά συστήματα ως κύτταρα ξενιστές λόγω του χαμηλού τους κόστους και της απλότητας τους. Αυτό εφαρμόστηκε και στην παρούσα διπλωματική εργασία, όπου σχεδιάστηκε και μελετήθηκε η έκφραση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης, μίας όξινης γλυκοπρωτεϊνικής ορμόνης 165 αμινοξέων, σε συνθήκες εργαστηριακής κλίμακας καθώς και σε βιοαντιδραστήρα πάγκου. Για να μπορέσει να αξιοποιηθεί ο βιοαντιδαστήρας, χρειάστηκε να γίνει πρώτα ο έλεγχος απόδοσής του με μία καλά μελετημένη πρωτεΐνη, την Arkadia, η οποία εκφράστηκε και απομονώθηκε ώστε να συγκριθεί με την αντίστοιχη πρωτεΐνη προερχόμενη από τη συμβατική παραγωγή σε φλάσκα. Αφού ο έλεγχος υπήρξε ικανοποιητικός, ακολούθησε η παραγωγή της πρωτεΐνης ενδιαφέροντος.
Πιο συγκεκριμένα, το γονίδιο που εκφράζει την ερυθροποιητίνη εισήχθη σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα και στη συνέχεια το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μετασχηματίστηκε σε βακτηριακά κύτταρα E. coli . Η έκφραση της πρωτεΐνης ενδιαφέροντος ελέγθηκε σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές του εν λόγω βακτηρίου, τα κύτταρα E. cloni EXPRESS και τα Rosetta2(DE3)pLysS και συγκρίθηκε η απόδοση με τη χρήση φλάσκας και βιοαντιδραστήρα.
Μετά την ολοκλήρωση των πειραμάτων αποδείχθηκε ότι με την 1η κυτταρική σειρά επιτεύχθηκε καλύτερη απόδοση στην έκφραση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης (rhEPO). Ακολούθησε η προσπάθεια απομόνωσης της μέσω χρωματογραφίας συγγένειας. Η απόδοση της
παραγόμενης πρωτεΐνης ήταν αρκετά ικανοποιητική, ωστόσο δεν επιτεύχθηκε η απομόνωση της με υψηλή καθαρότητα. Αξίζει να αναφερθεί, επίσης, ότι παρατηρείται ισχυρότερη έκφραση του προϊόντος όταν αυτό προέρχεται από καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα, ωστόσο θα πρέπει να διερευνηθούν οι συνθήκες για την επίτευξη της απομόνωσης της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης και της εύρεσης του κατάλληλου διαλύματος, στο οποίο θα παραμένει σταθερή. |
| author2 |
Giovanaki, Myrto |
| author_facet |
Giovanaki, Myrto Γιοβανάκη, Μυρτώ |
| author |
Γιοβανάκη, Μυρτώ |
| author_sort |
Γιοβανάκη, Μυρτώ |
| title |
Συστηματική μελέτη και βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μικρής κλίμακας βιοαντιδραστήρα |
| title_short |
Συστηματική μελέτη και βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μικρής κλίμακας βιοαντιδραστήρα |
| title_full |
Συστηματική μελέτη και βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μικρής κλίμακας βιοαντιδραστήρα |
| title_fullStr |
Συστηματική μελέτη και βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μικρής κλίμακας βιοαντιδραστήρα |
| title_full_unstemmed |
Συστηματική μελέτη και βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μικρής κλίμακας βιοαντιδραστήρα |
| title_sort |
συστηματική μελέτη και βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μικρής κλίμακας βιοαντιδραστήρα |
| publishDate |
2023 |
| url |
https://hdl.handle.net/10889/24784 |
| work_keys_str_mv |
AT giobanakēmyrtō systēmatikēmeletēkaibeltistopoiēsētōnsynthēkōnkalliergeiasanasyndyasmenōnprōteïnōnsemikrēsklimakasbioantidrastēra AT giobanakēmyrtō systematicstudyandoptimizationofrecombinantproteincultureconditionsinasmallscalebioreactor |
| _version_ |
1801184883711672320 |
| spelling |
nemertes-10889-247842023-03-11T04:36:53Z Συστηματική μελέτη και βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μικρής κλίμακας βιοαντιδραστήρα Systematic study and optimization of recombinant protein culture conditions in a small-scale bioreactor Γιοβανάκη, Μυρτώ Giovanaki, Myrto Ερυθροποιητίνη Βιοαντιδραστήρες Καλλιέργεια κυττάρων Erythropoietin Bioreactors Cell culture Με την πάροδο των χρόνων έχει αποδειχθεί πως η συνεχής μελέτη, βελτίωση και παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών αποτελεί έναν από τους ακρογωνιαίους λίθους της σύγχρονης επιστημονικής κοινότητας. Η πρόοδος που έχει σημειωθεί στον συγκεκριμένο τομέα συνεισφέρει στην εξέλιξη των βιοτεχνολογικών μεθόδων, της ιατρικής καθώς και στον δομικό προσδιορισμό των στόχων των φαρμάκων. Για την παραγωγή των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται κατά κανόνα βακτηριακά συστήματα ως κύτταρα ξενιστές λόγω του χαμηλού τους κόστους και της απλότητας τους. Αυτό εφαρμόστηκε και στην παρούσα διπλωματική εργασία, όπου σχεδιάστηκε και μελετήθηκε η έκφραση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης, μίας όξινης γλυκοπρωτεϊνικής ορμόνης 165 αμινοξέων, σε συνθήκες εργαστηριακής κλίμακας καθώς και σε βιοαντιδραστήρα πάγκου. Για να μπορέσει να αξιοποιηθεί ο βιοαντιδαστήρας, χρειάστηκε να γίνει πρώτα ο έλεγχος απόδοσής του με μία καλά μελετημένη πρωτεΐνη, την Arkadia, η οποία εκφράστηκε και απομονώθηκε ώστε να συγκριθεί με την αντίστοιχη πρωτεΐνη προερχόμενη από τη συμβατική παραγωγή σε φλάσκα. Αφού ο έλεγχος υπήρξε ικανοποιητικός, ακολούθησε η παραγωγή της πρωτεΐνης ενδιαφέροντος. Πιο συγκεκριμένα, το γονίδιο που εκφράζει την ερυθροποιητίνη εισήχθη σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα και στη συνέχεια το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μετασχηματίστηκε σε βακτηριακά κύτταρα E. coli . Η έκφραση της πρωτεΐνης ενδιαφέροντος ελέγθηκε σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές του εν λόγω βακτηρίου, τα κύτταρα E. cloni EXPRESS και τα Rosetta2(DE3)pLysS και συγκρίθηκε η απόδοση με τη χρήση φλάσκας και βιοαντιδραστήρα. Μετά την ολοκλήρωση των πειραμάτων αποδείχθηκε ότι με την 1η κυτταρική σειρά επιτεύχθηκε καλύτερη απόδοση στην έκφραση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης (rhEPO). Ακολούθησε η προσπάθεια απομόνωσης της μέσω χρωματογραφίας συγγένειας. Η απόδοση της παραγόμενης πρωτεΐνης ήταν αρκετά ικανοποιητική, ωστόσο δεν επιτεύχθηκε η απομόνωση της με υψηλή καθαρότητα. Αξίζει να αναφερθεί, επίσης, ότι παρατηρείται ισχυρότερη έκφραση του προϊόντος όταν αυτό προέρχεται από καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα, ωστόσο θα πρέπει να διερευνηθούν οι συνθήκες για την επίτευξη της απομόνωσης της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης και της εύρεσης του κατάλληλου διαλύματος, στο οποίο θα παραμένει σταθερή. Over the years it has been proven that the continuous study, improvement and production of recombinant proteins is one of the cornerstones of the modern scientific community. The progress that has been made in this field contributes to the development of biotechnological methods, medicine as well as the structural definition of drug targets. Bacterial systems are generally used as host cells for the production of recombinant proteins due to their low cost and simplicity. This was the case in the present thesis, where the expression of recombinant human erythropoietin, an acidic glycoprotein hormone of 165 amino acids, was designed and studied under laboratory-scale conditions as well as in a bench-top bioreactor. In order to be able to exploit the bioreactor, it was first necessary to test its performance with a well-studied protein, called Arkadia, which was expressed and isolated to compare it with the corresponding protein derived from conventional production in a flask. Since the control was satisfactory, the production of the protein of interest followed. More specifically, the gene expressing erythropoietin was introduced into the appropriate plasmid vector and then the recombinant plasmid was transformed into bacterial cells of E. coli. The expression of the protein of interest was tested in two different cell lines of this bacterium, E. cloni EXPRESS and Rosetta2(DE3)pLysS cells in culture in a flake and bioreactor. After completion of the experiments, it was shown that better performance in the expression of recombinant human erythropoietin (rhEPO) was achieved with the 1st cell line. This was followed by an attempt to isolate it by affinity chromatography. The yield of the resulting protein was quite satisfactory, however, its isolation with high purity was not achieved. It is also worth mentioning that stronger expression of the product is observed when it is obtained from culture in a bioreactor, however, the conditions for achieving isolation of recombinant human erythropoietin and finding the appropriate solution in which it remains stable should be investigated 2023-03-10T11:40:51Z 2023-03-10T11:40:51Z 2023-03-08 https://hdl.handle.net/10889/24784 el CC0 1.0 Universal http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/ application/pdf |
