| Περίληψη: | Η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό βιομακρομορίων αποτελεί αντικείμενο ευρείας ερευνητικής δραστηριότητας. Στην παρούσα διπλωματική μεταπτυχιακή εργασία, αναπτύχθηκε μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού ανθρωπίνων αντισωμάτων έναντι του ιού SARS – CoV -2. Το αντίσωμα είναι γλυκοπρωτεΐνη που συνδέεται εκλεκτικά και μη ομοιοπολικά με ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Με τη σύνδεση αυτή το ανοσοποιητικό σύστημα επιδιώκει την εξουδετέρωση της δράσης των ανεπιθύμητων αντιγόνων και διευκολύνει τη φαγοκυττάρωση των μικροοργανισμών που τα φέρουν στην επιφάνεια τους. Η μέθοδος, που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο της διπλωματικής εργασίας, βασίζεται στην αξιοποίηση της φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης σε σύζευγμα με αντίσωμα έναντι των ανθρωπίνων αντισωμάτων. Η αικουορίνη αποτελεί μέλος των φωτοπρωτεϊνών που δεσμεύουν δισθενή ιόντα ασβεστίου. Μέσω διαμοριακής αντίδρασης με τα ιόντα ασβεστίου παρατηρείται εκπομπή μπλε φωτός. Για το σκοπό αυτό, αρχικά πραγματοποιήθηκε έκφραση της αικουορίνης σε μετασχηματισμένα βακτηριακά στελέχη της Escherichia Coli και ακολούθησε η απομόνωσή της με χρωματογραφία ακινητοποιημένου μετάλλου. Έγινε η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης και τέλος ο καθαρισμός της με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Η πρωτεΐνη που απομονώθηκε συζεύχθηκε ομοιοπολικά με αντίσωμα προβάτου που αναγνωρίζει ανθρώπινα αντισώματα για το σχηματισμό του επιθυμητού ιχνηθέτη. Στη μέθοδο που αναπτύχθηκε, πραγματοποιείται ο ποσοτικός προσδιορισμός ανθρώπινων αντισωμάτων έναντι της υπομονάδας S1 της πρωτεΐνης ακίδας του ιού η οποία ακινητοποιήθηκε σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης μέσω της αλληλεπίδρασης βιοτίνης – στρεπταβιδίνης. Η ακινητοποίηση της S1 εξασφαλίζει την εκλεκτική δέσμευση των αντισωμάτων έναντι του ιού. Η μέτρηση της χημειοφωταύγειας του ιχνηθέτη πραγματοποιήθηκε ύστερα από τη προσθήκη διαλύματος που περιείχε δισθενή ιόντα ασβεστίου.
Επιπλέον, στην παρούσα διπλωματική εργασία παρουσιάζεται η ανάπτυξη μεθόδου για την ανίχνευση DNA – στόχων με τη χρήση βιοαισθητήρα τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια αλλά και προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) υποβλήθηκαν σε αντίδραση επέκτασης του εκκινητή (Primer Extension reaction, PEXT). Μέσω της αντίδρασης PEXT, είναι δυνατή η ανίχνευση μονοκουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs). Στην αντίδραση επέκτασης του εκκινητή, χρησιμοποιούνται εκκινητές ειδικοί για το κάθε DNA – στόχο. Τα προϊόντα της αντίδρασης PEXT ανιχνεύθηκαν οπτικά στον βιοαιασθητήρα που αναπτύχθηκε με τη χρήση νανοσωματιδίων χρυσού. Τέλος, παρουσιάζεται η ανάπτυξη πολλαπλού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση πολλαπλών στόχων ταυτόχρονα
|
|---|
