Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για ανίχνευση/προσδιορισμό βιομακρομορίων
Η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό βιομακρομορίων αποτελεί αντικείμενο ευρείας ερευνητικής δραστηριότητας. Στην παρούσα διπλωματική μεταπτυχιακή εργασία, αναπτύχθηκε μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού ανθρωπίνων αντισωμάτων έναντι του ιού SARS – CoV -2. Το αντ...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2023
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | https://hdl.handle.net/10889/25031 |
| id |
nemertes-10889-25031 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Αικουορίνη Αντίδραση επέκτασης εκκινητή Συζεύγματα Ανθρώπινα αντισώματα Βιοαισθητήρες Aequorin Conjugates Biosensors Human antibodies Primer extension reaction |
| spellingShingle |
Αικουορίνη Αντίδραση επέκτασης εκκινητή Συζεύγματα Ανθρώπινα αντισώματα Βιοαισθητήρες Aequorin Conjugates Biosensors Human antibodies Primer extension reaction Μητσιάκου, Αγλαΐα Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για ανίχνευση/προσδιορισμό βιομακρομορίων |
| description |
Η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό βιομακρομορίων αποτελεί αντικείμενο ευρείας ερευνητικής δραστηριότητας. Στην παρούσα διπλωματική μεταπτυχιακή εργασία, αναπτύχθηκε μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού ανθρωπίνων αντισωμάτων έναντι του ιού SARS – CoV -2. Το αντίσωμα είναι γλυκοπρωτεΐνη που συνδέεται εκλεκτικά και μη ομοιοπολικά με ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Με τη σύνδεση αυτή το ανοσοποιητικό σύστημα επιδιώκει την εξουδετέρωση της δράσης των ανεπιθύμητων αντιγόνων και διευκολύνει τη φαγοκυττάρωση των μικροοργανισμών που τα φέρουν στην επιφάνεια τους. Η μέθοδος, που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο της διπλωματικής εργασίας, βασίζεται στην αξιοποίηση της φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης σε σύζευγμα με αντίσωμα έναντι των ανθρωπίνων αντισωμάτων. Η αικουορίνη αποτελεί μέλος των φωτοπρωτεϊνών που δεσμεύουν δισθενή ιόντα ασβεστίου. Μέσω διαμοριακής αντίδρασης με τα ιόντα ασβεστίου παρατηρείται εκπομπή μπλε φωτός. Για το σκοπό αυτό, αρχικά πραγματοποιήθηκε έκφραση της αικουορίνης σε μετασχηματισμένα βακτηριακά στελέχη της Escherichia Coli και ακολούθησε η απομόνωσή της με χρωματογραφία ακινητοποιημένου μετάλλου. Έγινε η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης και τέλος ο καθαρισμός της με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Η πρωτεΐνη που απομονώθηκε συζεύχθηκε ομοιοπολικά με αντίσωμα προβάτου που αναγνωρίζει ανθρώπινα αντισώματα για το σχηματισμό του επιθυμητού ιχνηθέτη. Στη μέθοδο που αναπτύχθηκε, πραγματοποιείται ο ποσοτικός προσδιορισμός ανθρώπινων αντισωμάτων έναντι της υπομονάδας S1 της πρωτεΐνης ακίδας του ιού η οποία ακινητοποιήθηκε σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης μέσω της αλληλεπίδρασης βιοτίνης – στρεπταβιδίνης. Η ακινητοποίηση της S1 εξασφαλίζει την εκλεκτική δέσμευση των αντισωμάτων έναντι του ιού. Η μέτρηση της χημειοφωταύγειας του ιχνηθέτη πραγματοποιήθηκε ύστερα από τη προσθήκη διαλύματος που περιείχε δισθενή ιόντα ασβεστίου.
Επιπλέον, στην παρούσα διπλωματική εργασία παρουσιάζεται η ανάπτυξη μεθόδου για την ανίχνευση DNA – στόχων με τη χρήση βιοαισθητήρα τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια αλλά και προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) υποβλήθηκαν σε αντίδραση επέκτασης του εκκινητή (Primer Extension reaction, PEXT). Μέσω της αντίδρασης PEXT, είναι δυνατή η ανίχνευση μονοκουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs). Στην αντίδραση επέκτασης του εκκινητή, χρησιμοποιούνται εκκινητές ειδικοί για το κάθε DNA – στόχο. Τα προϊόντα της αντίδρασης PEXT ανιχνεύθηκαν οπτικά στον βιοαιασθητήρα που αναπτύχθηκε με τη χρήση νανοσωματιδίων χρυσού. Τέλος, παρουσιάζεται η ανάπτυξη πολλαπλού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση πολλαπλών στόχων ταυτόχρονα |
| author2 |
Mitsiakou, Aglaia |
| author_facet |
Mitsiakou, Aglaia Μητσιάκου, Αγλαΐα |
| author |
Μητσιάκου, Αγλαΐα |
| author_sort |
Μητσιάκου, Αγλαΐα |
| title |
Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για ανίχνευση/προσδιορισμό βιομακρομορίων |
| title_short |
Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για ανίχνευση/προσδιορισμό βιομακρομορίων |
| title_full |
Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για ανίχνευση/προσδιορισμό βιομακρομορίων |
| title_fullStr |
Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για ανίχνευση/προσδιορισμό βιομακρομορίων |
| title_full_unstemmed |
Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για ανίχνευση/προσδιορισμό βιομακρομορίων |
| title_sort |
ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για ανίχνευση/προσδιορισμό βιομακρομορίων |
| publishDate |
2023 |
| url |
https://hdl.handle.net/10889/25031 |
| work_keys_str_mv |
AT mētsiakouaglaïa anaptyxēanalytikōnmethodōngiaanichneusēprosdiorismobiomakromoriōn AT mētsiakouaglaïa developmentofanalyticalmethodsfordetectiondeterminationofbiomolecules |
| _version_ |
1771297221663260672 |
| spelling |
nemertes-10889-250312023-06-08T03:55:01Z Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για ανίχνευση/προσδιορισμό βιομακρομορίων Development of analytical methods for detection/determination of biomolecules Μητσιάκου, Αγλαΐα Mitsiakou, Aglaia Αικουορίνη Αντίδραση επέκτασης εκκινητή Συζεύγματα Ανθρώπινα αντισώματα Βιοαισθητήρες Aequorin Conjugates Biosensors Human antibodies Primer extension reaction Η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό βιομακρομορίων αποτελεί αντικείμενο ευρείας ερευνητικής δραστηριότητας. Στην παρούσα διπλωματική μεταπτυχιακή εργασία, αναπτύχθηκε μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού ανθρωπίνων αντισωμάτων έναντι του ιού SARS – CoV -2. Το αντίσωμα είναι γλυκοπρωτεΐνη που συνδέεται εκλεκτικά και μη ομοιοπολικά με ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Με τη σύνδεση αυτή το ανοσοποιητικό σύστημα επιδιώκει την εξουδετέρωση της δράσης των ανεπιθύμητων αντιγόνων και διευκολύνει τη φαγοκυττάρωση των μικροοργανισμών που τα φέρουν στην επιφάνεια τους. Η μέθοδος, που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο της διπλωματικής εργασίας, βασίζεται στην αξιοποίηση της φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης σε σύζευγμα με αντίσωμα έναντι των ανθρωπίνων αντισωμάτων. Η αικουορίνη αποτελεί μέλος των φωτοπρωτεϊνών που δεσμεύουν δισθενή ιόντα ασβεστίου. Μέσω διαμοριακής αντίδρασης με τα ιόντα ασβεστίου παρατηρείται εκπομπή μπλε φωτός. Για το σκοπό αυτό, αρχικά πραγματοποιήθηκε έκφραση της αικουορίνης σε μετασχηματισμένα βακτηριακά στελέχη της Escherichia Coli και ακολούθησε η απομόνωσή της με χρωματογραφία ακινητοποιημένου μετάλλου. Έγινε η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης και τέλος ο καθαρισμός της με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Η πρωτεΐνη που απομονώθηκε συζεύχθηκε ομοιοπολικά με αντίσωμα προβάτου που αναγνωρίζει ανθρώπινα αντισώματα για το σχηματισμό του επιθυμητού ιχνηθέτη. Στη μέθοδο που αναπτύχθηκε, πραγματοποιείται ο ποσοτικός προσδιορισμός ανθρώπινων αντισωμάτων έναντι της υπομονάδας S1 της πρωτεΐνης ακίδας του ιού η οποία ακινητοποιήθηκε σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης μέσω της αλληλεπίδρασης βιοτίνης – στρεπταβιδίνης. Η ακινητοποίηση της S1 εξασφαλίζει την εκλεκτική δέσμευση των αντισωμάτων έναντι του ιού. Η μέτρηση της χημειοφωταύγειας του ιχνηθέτη πραγματοποιήθηκε ύστερα από τη προσθήκη διαλύματος που περιείχε δισθενή ιόντα ασβεστίου. Επιπλέον, στην παρούσα διπλωματική εργασία παρουσιάζεται η ανάπτυξη μεθόδου για την ανίχνευση DNA – στόχων με τη χρήση βιοαισθητήρα τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια αλλά και προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) υποβλήθηκαν σε αντίδραση επέκτασης του εκκινητή (Primer Extension reaction, PEXT). Μέσω της αντίδρασης PEXT, είναι δυνατή η ανίχνευση μονοκουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs). Στην αντίδραση επέκτασης του εκκινητή, χρησιμοποιούνται εκκινητές ειδικοί για το κάθε DNA – στόχο. Τα προϊόντα της αντίδρασης PEXT ανιχνεύθηκαν οπτικά στον βιοαιασθητήρα που αναπτύχθηκε με τη χρήση νανοσωματιδίων χρυσού. Τέλος, παρουσιάζεται η ανάπτυξη πολλαπλού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση πολλαπλών στόχων ταυτόχρονα The development of new analytical methods for the detection and quantitative determination of biomolecules is a subject of extensive research activity. In the present diploma thesis, it is shown the development of an analytical method for the quantitative determination of human antibodies against SARS -CoV -2. The human antibody is a glycoprotein that binds to a specific antigen. Through this binding, the immune system seeks to neutralize the action of unwanted antigens and facilitate the phagocytosis of microorganisms that bear them on their surface. Aequorin is a member of the photoproteins that bind to calcium ions. The binding triggers the emission of blue light. Aequorin expression was first performed in transformed bacterial strains of Escherichia Coli, followed by isolation using immobilized metal chromatography. The protein was activated and then purified using hydrophobic interaction chromatography. The isolated protein was covalently conjugated with an antibody recognizing human antibodies. The developed method detects antibodies against the S1 subunit of the spike protein of the SARS – CoV-2 which was immobilized on the surface of microtiter wells through biotin – streptavidin interaction. The S1 immobilization ensures the selective binding of antibodies against the virus. Chemiluminescence of the photoprotein reporter was measured after the addition of a solution containing calcium dithionate ions. In addition, this thesis presents the development of a method for detecting DNA targets using a dipstick – type biosensor. Synthetic oligonucleotides as well as PCR products were subjected to a Primer Extension reaction (PEXT) which can detect single nucleotide polymorphisms (SNPs). In the reaction, primers specific to each DNA target are used. The products of the PEXT reaction were visually detected on the biosensor developed using gold nanoparticles. Finally, the development of a multiple biosensor for the simultaneous detection of multiple targets is presented. 2023-06-02T10:23:57Z 2023-06-02T10:23:57Z 2023-05-30 https://hdl.handle.net/10889/25031 el application/pdf |
