Χαρακτηρισμός και μελέτη του ρόλου της DEAΗ-box ελικάσης DHX35

• Main Author: Γεντεκάκη, Αικατερίνη
• Other Authors: Gentekaki, Ekaterini
• Language: Greek
• Published: 2023
• Subjects: RNA ελικάσες; DEAH-box ελικάσες; RNA helicases; DEAH-box helicases; DHX35

Οι ελικάσες αποτελούν ένζυμα εξέχουσας σημασίας για την επιβίωση και τη σωστή λειτουργία των κυττάρων, καθώς συναντώνται και στα τρία βασίλεια της ζωής και είναι απαραίτητα σε όλες τις διεργασίες του μεταβολισμού των νουκλεϊκών οξεών. Οι ελικάσες συμμετέχουν κυρίως στο ξετύλιγμα μορίων DNA, RNA ή και υβριδίων DNA-RNA, καθώς και στην αναδιαμόρφωση ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων. Με βάση παλαιότερες έρευνες αναγνωρίσαμε μία πιθανή και μη χαρακτηρισμένη RNA ελικάση, η οποία φαινόταν να εμπλέκεται στη σύνθεση και την επεξεργασία του ριβοσωμικού RNA, γνωστή ως DEAH-box πολυπεπτίδιο 35 (DHX35). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασε η διαφορική έκφραση της ελικάσης DHX35 τόσο σε καρκινικές σειρές μελανώματος και καρκίνου του πνεύμονα όσο και σε δείγματα ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Αυτή η παρατήρηση μας ώθησε να διερευνήσουμε περαιτέρω τη βιολογική λειτουργία και το μηχανιστικό ρόλο της DHX35. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε ενδοκυτταρικός εντοπισμός της DXH35 στο κυτταρόπλασμα των HEK-293T κυττάρων μέσω ανοσοφθορισμού. Έτσι, κλωνοποιήσαμε και υπερεκφράσαμε την DHX35 σε ένα ετερόλογο σύστημα Escherichia coli. Η ανασυνδιασμένη DHX35 απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας και ύστερα ελέγχθηκε η ικανότητα δέσμευσής της σε διάφορα υποστρώματα. Παρατηρήθηκε ότι η DHX35 προσδένεται αποκλειστικά σε μόρια RNA που παρουσιάζουν δίκλωνη περιοχή με προεξέχοντα 3’ άκρα, όπως σε snoRNAs (π.χ. SNORD78 και SNORA73B) και σε πρόδρομα tRNAs. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε απαλοιφή της DHX35 ελικάσης από την καρκινική σειρά HeLa με τη χρήση του εργαλείου γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR/Cas9 με σκοπό την αποσαφήνιση του βιολογικού της ρόλου. Τα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη μεταβολική ενεργότητα και μεγαλύτερη παραμονή στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου.