| Περίληψη: | Τα τελευταία χρόνια, πολλά εργαστήρια έχουν επικεντρώσει το ενδιαφέρον τους στο 5S rRNA, το μικρότερο RNA συστατικό του ριβοσώματος. Ο ακριβής ρόλος του 5S rRNA στο ριβόσωμα, την πρωτεϊνική βιοσυνθετική μηχανή, δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί. Αποτελέσματα δομικών μελετών τοποθετούν το 5S rRNA στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Ευρήματα που αφορούν σχέσεις δομής και λειτουργίας οδηγούν στην υπόθεση, ότι σταθεροποιεί τη δομή του ριβοσώματος και λειτουργεί ως φυσικός μεταδότης πληροφοριών μεταξύ λειτουργικών κέντρων. Από την άλλη πλευρά, το ιοντικό περιβάλλον επηρεάζει άμεσα τη ριβοσωματική λειτουργία. Μονοσθενή και δισθενή κατιόντα, καθώς και πολυκατιόντα, όπως οι πολυαμίνες, παρεμβαίνουν στη ριβοσωματική διαμόρφωση και συνεπώς εμπλέκονται άμεσα στη λειτουργία του ριβοσώματος. Προκαρτατικές μελέτες στο εργαστήριό μας έχουν δείξει ότι οι πολυαμίνες, και συγκεκριμένα η σπερμίνη, σταθεροποιούν την δευτεροταγή και τριτοταγή δομή του 5S rRNA, οδηγώντας σε μια πιο συνεκτική διαμόρφωση του μορίου.
Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της διαμόρφωσης του 5S rRNA στην πρωτεϊνική σύνθεση του εντεροβακτηρίου E.coli. Παράλληλος στόχος ήταν η μελέτη της επίδρασης των πολυαμινών στη δομή και λειτουργία τόσο του 5S rRNA, όσο και ολοκλήρου του ριβοσωματικού συμπλόκου.
Η πρόσδεση των πολυαμινών στο 5S rRNA μελετήθηκε με τη μέθοδο της φωτοσήμανσης συγγένειας, χρησιμοποιώντας ως μοριακό ανιχνευτή ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, την ΑΒΑ-σπερμίνη. Πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της πρόσδεσης και προσδιορίστηκαν οι θέσεις δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rRNA, είτε αυτό ήταν ελεύθερο, είτε ενσωματωμένο σε 50S ριβοσωματικές υπομονάδες ή 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα από E.coli. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι σε ελεύθερο 5S rRNA, η σπερμίνη προσδένεται κυρίως σε νουκλεοτίδια των ελίκων III και V και στις θηλιές Α, C, D και E. Ενσωμάτωση του 5S rRNA σε 50S υπομονάδες ή 70S poly(U)-προγραμματισμένα ριβοσώματα, είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση της επιδεκτικότητας των νουκλεοτιδίων του στην ΑΒΑ-σπερμίνη. Ακολούθησε διερεύνηση των επιπτώσεων της πρόσδεσης του φωτοαναλόγου στη δομή του 5S rRNA. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα χημικής τροποποίησης, τα οποία αποκάλυψαν ότι ανεξάρτητα από το αν το 5S rRNA είναι ελεύθερο ή συναρμολογημένο σε 50S υπομονάδες ή σε 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα, η πρόσδεση της ΑΒΑ-σπερμίνης προκαλεί σημαντικές αλλαγές στη διαμόρφωση του μορίου. Η θηλιά Α υιοθετεί μια πιο χαλαρή δομή, ενώ οι θηλιές C, D και E και η έλικα III μια πιο συνεκτική δομή.
Με την διαπίστωση των αλλαγών της διαμόρφωσης του 5S rRNA λόγω της πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης, κρίθηκε ενδιαφέρον να μελετηθεί αν αυτές οι διαμορφωτικές αλλαγές επηρεάζουν θεμελιώδεις λειτουργίες του ριβοσώματος. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην ικανότητα του να συναρμολογείται σε 50S υπομονάδες και 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρόσδεση της ΑΒΑ-σπερμίνη στο 5S rRNA, δεν καταργεί την διαδικασία συναρμολόγησης των 50S υπομονάδων, παρεμποδίζει όμως τις απαιτούμενες δομικές αλλαγές με το να σταθεροποιεί μια πιο συνεκτική δομή του 5S rRNA, θερμοδυναμικά λιγότερο ευνοϊκή για την πορεία. Παρά το γεγονός ότι η πρόσδεση της σπερμίνης στο 5S rRNA επιφέρει στο μόριο δομικές αλλαγές που εμποδίζουν την συναρμολόγηση του σε 50S υπομονάδες, όταν αυτές σχηματιστούν, αποκτούν δομή τέτοια που επιτρέπει την αλληλεπίδρασή τους με τις 30S υπομονάδες. Ωστόσο, η παρουσία του 5S rRNA φαίνεται να είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό ενεργών 50S υπομονάδων, αφού η απουσία του 5S rRNA δεν επιτρέπει ούτε το σχηματισμό ακέραιων υπομονάδων, ούτε την σύζευξη των υπομονάδων προς ακέραια ριβοσωματικά σύμπλοκα.
Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rRNA, αρχικά στην ικανότητα των ριβοσωμάτων να προσδένουν υπόστρωμα και στη συνέχεια, στην καταλυτική δράση αυτών. Φωτοσήμανση του 5S rRNA με ΑΒΑ-σπερμίνη προκάλεσε μικρή, αλλά σαφή ενεργοποίηση της πρόσδεσης υποστρώματος στην Ρ-θέση, σε αντίθεση με την πρόσδεση στην Α-θέση, η οποία δε φαίνεται να επηρεάζεται. Σαφής ήταν, επίσης, η επίδραση στην ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης: Παρατηρήθηκε αύξηση μέχρι και 30% στη δραστικότητα της ΡΤασης. Ιδιαίτερης σημασίας είναι το εύρημα, ότι ριβοσώματα ελλιπή σε 5S διατηρούν ~10% της δράσης της ΡΤασης, γεγονός που οδηγεί στη υπόθεση ότι το 5S rRNA δεν είναι απολύτως απαραίτητο για τη κατάλυση του πεπτιδικού δεσμού.
Ακολούθησε η μελέτη της επίδρασης της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην μετατόπιση υποστρωμάτων, αρχικά στην αυθόρμητη (μη ενζυμική) και στη συνέχεια στην EF-G-καταλυόμενη μετατόπιση. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την υπόθεση, ότι η μετατόπιση υποστρωμάτων είναι έμφυτη ιδιότητα του ριβοσώματος. Παράλληλα, κατέδειξαν ότι η πρόσδεση σπερμίνης στο 5S rRNA διεγείρει την μη ενζυμική μετατόπιση, πιθανόν μέσω αλλαγών στην αναδίπλωση του rRNA, οι οποίες μεταδίδονται στα ριβοσωματικά κέντρα που είναι υπεύθυνα για αυτή τη λειτουργία. Περαιτέρω, η παρουσία σπερμίνης στο 5S rRNA, μείωσε τις απαιτήσεις για EF-G. Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να εξηγηθεί είτε με μια πιθανή ευεργετική δράση της σπερμίνης στην δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, είτε με την επίδρασή της στο στάδιο της υδρόλυσης του GTP. Για να διευκρινίσουμε ποια από τις δυο εκδοχές ευσταθεί, μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rRNA στην ικανότητα ριβοσωμάτων να δεσμεύουν EF-G και στη συνέχεια στην ικανότητα τους να ενεργοποιούν την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση. Βρέθηκε ότι, η παρουσία σπερμίνης στο μόριο του 5S rRNA, ευνοεί τη δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα. ¨Όσο αφορά την ικανότητα του ριβοσώματος να ενεργοποιεί την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης δεν επηρεάζεται από την παρουσία σπερμίνης, αποτέλεσμα που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rRNA δεν επηρεάζει την GTP υδρόλυση. Απουσία του 5S rRNA, τα ριβοσώματα διατηρούν κάποια δραστικότητα GTPασης, αλλά δεν είναι ικανά να δεσμεύουν αποτελεσματικά τον EF-G, ακόμη και παρουσία σπερμίνης. Λαμβάνοντας υπόψη, ότι η θέση δέσμευσης του EF-G στο ριβόσωμα βρίσκεται στα domain II και VI του 23S rRNA και ότι απευθείας επαφές του 5S rRNA με αυτές τις περιοχές ή με τον EF-G δεν έχουν βρεθεί, οδηγούμαστε στην υπόθεση ότι, το 5S rRNA, μέσω αλλοστερικών σημάτων, επηρεάζει την EF-G-GTP δέσμευση στο ριβόσωμα, όχι όμως και την GTP υδρόλυση.
Για να επιβεβαιώσουμε τα παραπάνω, μελετήθηκε η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος και η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rRNA, στη διαμορφωτική κατάσταση θεμελιωδών λειτουργικών κέντρων του ριβοσώματος. Η μελέτη εστιάστηκε στην ικανότητα του 5S rRNA να επηρεάζει τα κέντρα πρόσδεσης του EF-G στο ριβόσωμα, καθώς και τις θέσεις Α- και Ρ- του ριβοσωμικού συμπλόκου. Διαπιστώθηκε ότι η αλληλεπίδραση ελεύθερης σπερμίνης με το ριβόσωμα ενισχύει το αποτύπωμα (footprinting) χημικής προστασίας νουκλεοτιδίων υπευθύνων για την πρόσδεση του ΕF-G και τη συγκρότηση της Ρ-θέσης, όχι όμως και της Α-θέσης. Παρόμοια, αλλά μικρότερου βαθμού, ήταν και η επίδραση της προσδενομένης επιλεκτικά ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rRNA.
Συμπερασματικά, το 5S rRNA περιέχει θέσεις εξειδικευμένης πρόσδεσης πολυαμινών, οι οποίες επηρεάζουν την τριτοταγή του διαμόρφωση. Η δέσμευση της σπερμίνης στο 5S rRNA φαίνεται να μην επηρεάζει σημαντικά την ικανότητα της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας να δεσμεύει υπόστρωμα, βελτιώνει όμως την καταλυτική δραστικότητα του ριβοσώματος και την ικανότητα του να μετατοπίζει τα υποστρώματα. Οι πολυαμίνες ενεργοποιούν την δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, αλλά ελάχιστα επηρεάζουν την υδρόλυση του GTP από τον EF-G. Εν κατακλείδι, το 5S rRNA φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταγωγή σημάτων μεταξύ του καταλυτικού κέντρου και της περιοχής πρόσδεσης EFG.
|
|---|
