Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού και των αντιμυκητιασικών ιδιοτήτων πολυμερικών νανοσωματιδίων στον υφομύκητα Aspergillus nidulans
Η παρούσα εργασία διερευνά τη χρήση πολυμερικών νανοσωματιδίων πολυ(αιθυλενιμίνης) ως παράγοντες με πιθανές αντιμυκητιασικές ιδιότητες. Η υπόθεση αυτή εργασίας βασίζεται σε πληθώρα βιβλιογραφικών δεδομένων που έχουν υποδείξει τις αντιμικροβιακές ιδιότητες που εκδηλώνουν τα συγκεκριμένα πολυμερή καθώ...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2023
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | https://hdl.handle.net/10889/25601 |
| id |
nemertes-10889-25601 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Υπερδιακλαδισμένα πολυμερή Αντιμυκητιασικά Aspergillus nidulans Ηyperbranched polymers Antifungals |
| spellingShingle |
Υπερδιακλαδισμένα πολυμερή Αντιμυκητιασικά Aspergillus nidulans Ηyperbranched polymers Antifungals Γεροστάθης, Σπύρος Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού και των αντιμυκητιασικών ιδιοτήτων πολυμερικών νανοσωματιδίων στον υφομύκητα Aspergillus nidulans |
| description |
Η παρούσα εργασία διερευνά τη χρήση πολυμερικών νανοσωματιδίων πολυ(αιθυλενιμίνης) ως παράγοντες με πιθανές αντιμυκητιασικές ιδιότητες. Η υπόθεση αυτή εργασίας βασίζεται σε πληθώρα βιβλιογραφικών δεδομένων που έχουν υποδείξει τις αντιμικροβιακές ιδιότητες που εκδηλώνουν τα συγκεκριμένα πολυμερή καθώς και παράγωγά τους εναντίον βακτηρίων και άλλων μικροοργανισμών όπως είναι τα άλγη και κάποια είδη μυκήτων.
Χρησιμοποιώντας ως πρότυπο μοντέλο τον ευκαιριακά παθογόνο υφομύκητα Aspergillus nidulans, μελετήθηκε η αντιμυκητιασική δράση της υπερδιακλαδισμένης πολυ(αιθυλενιμίνης) (PEI) καθώς και των τροποποιημένων παραγώγων της με ομάδες γουανιδίνης (guanidinylated PEI, GPEI) ή με τεταρτοταγείς αμμωνιακές ομάδες (quaternized PEI, QPEI). Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε ο υποκυτταρικός εντοπισμός των νανοσωματιδίων αυτών σε αναπτυσσόμενες υφές του μύκητα, η επίδρασή τους στην ανάπτυξη των υφών και η ικανότητα τους να προκαλέσουν κυτταρικό θάνατο σε υφές αλλά και σε κονιδιοσπόρια. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός των νανοσωματιδίων πραγματοποιήθηκε μέσω μικροσκοπίας επιφθορισμού και συνεστιακής μικροσκοπίας laser. Μέσω της χρήσης των προαναφερθέντων τεχνικών/προσεγγίσεων, μελετήθηκε η τοξικότητα των νανοσωματιδίων μέσω της χρώσης τους με propidium iodide (PI), ουσίας που αποτελεί δείκτη κυτταρικού θανάτου. Η επίδραση των νανοσωματιδίων στην ανάπτυξη του μύκητα εκτιμήθηκε μέσω δοκιμασιών ανάπτυξης αξιοποιώντας φωτομετρικές μεθόδους (crystal violet microplate assay). Επιπρόσθετα, δεδομένα σχετικά με την τοξικότητα των νανοσωματιδίων αποκτήθηκαν μέσω δοκιμασιών επιβίωσης και συγκεκριμένα μέσω ποσοτικοποίησης της ανάκτησης της αύξησης κονιδιοσπορίων επωασμένων παρουσία των νανοσωματιδίων με τη μέθοδο καταμέτρησης αναπτυσσόμενων αποικιών (Colony formation assay).
Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα νανοσωματίδια, επισημασμένα με τη φθορίζουσα χρωστική ισοκυανική φθορεσκεΐνη (fluorescein isothiocyanate, FITC), εντοπίζονται αρχικά περιμετρικά της μεμβράνης του μύκητα τόσο στις υφές όσο και στα μη εκβλαστημένα αδρανή κονιδιοσπόρια του, ενώ στη συνέχεια εισέρχονται στο εσωτερικό τους. Ωστόσο, όταν βρίσκονται στον ενδοκυττάριο χώρο δεν φαίνονται να εντοπίζονται σε συγκεκριμένα οργανίδια. Όσον αφορά την επίδρασή τους στην ανάπτυξη του μύκητα, τα νανοσωματίδια εκδηλώνουν κυτταροστατικές ιδιότητες, εμποδίζοντας την εκβλάστηση και κατ’ επέκταση τον σχηματισμό υφών. Από τη σύγκριση μεταξύ των νανοσωματιδίων με διαφορετικές λειτουργικές τερματικές ομάδες εκτιμήθηκαν οι διαφορές στην κυτταροστατική ικανότητα τους, με το PEI να αποτελεί τον πιο ικανό αντιμυκητιασικό παράγοντα καθώς προκαλεί πλήρη αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (MIC = 120 nM) από το GPEI (ΜΙC = 210 nM) και το QPEI (ΜΙC = 230 nM). Συνεπώς, οι γουανιδινικές ομάδες φαίνεται να είναι πιο ικανοί αναστολείς της αύξησης των μυκήτων σε σύγκριση με τις τεταρτοταγείς αμινομάδες, ενώ και οι δύο αυτές ομάδες μειώνουν τη δραστικότητα του αρχικού πολυμερούς. Στη συνέχεια, χρώση με τη φθορίζουσα χρωστική PI έδειξε ότι η μεμβράνη των κυττάρων που έχουν αναπτυχθεί παρουσία των νανοσωματιδίων σε συγκεντρώσεις >MIC για επαρκές χρονικό διάστημα (30 - 60 λεπτά) εμφανίζει αυξημένη διαπερατότητα στη χρωστική, συνεπώς έχει διαταραχθεί η ακεραιότητά της προκαλώντας κυτταρικό θάνατο. Η μυκητοκτόνος δράση των νανοσωματιδίων επιβεβαιώθηκε και μέσω της μεθόδου καταμέτρησης αναπτυσσόμενων αποικιών. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου έδειξαν ότι τα κονιδιοσπόρια του μύκητα που έχουν υποστεί κατεργασία με τα νανοσωματίδια εμφανίζουν αδυναμία ανάκτησης αύξησης και συνεπώς η επιβίωση τους μειώνεται μέχρι και 70%. H μυκητοκτόνος δράση των νανοσωματιδίων συγκρίθηκε με αυτή της ιτρακοναζόλης, ενός γνωστού αντιμυκητιασικού φαρμάκου, και τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η δράση των νανοσωματιδίων είναι παρόμοια με αυτή της ιτρακοναζόλης. |
| author2 |
Gerostathis, Spyros |
| author_facet |
Gerostathis, Spyros Γεροστάθης, Σπύρος |
| author |
Γεροστάθης, Σπύρος |
| author_sort |
Γεροστάθης, Σπύρος |
| title |
Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού και των αντιμυκητιασικών ιδιοτήτων πολυμερικών νανοσωματιδίων στον υφομύκητα Aspergillus nidulans |
| title_short |
Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού και των αντιμυκητιασικών ιδιοτήτων πολυμερικών νανοσωματιδίων στον υφομύκητα Aspergillus nidulans |
| title_full |
Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού και των αντιμυκητιασικών ιδιοτήτων πολυμερικών νανοσωματιδίων στον υφομύκητα Aspergillus nidulans |
| title_fullStr |
Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού και των αντιμυκητιασικών ιδιοτήτων πολυμερικών νανοσωματιδίων στον υφομύκητα Aspergillus nidulans |
| title_full_unstemmed |
Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού και των αντιμυκητιασικών ιδιοτήτων πολυμερικών νανοσωματιδίων στον υφομύκητα Aspergillus nidulans |
| title_sort |
μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού και των αντιμυκητιασικών ιδιοτήτων πολυμερικών νανοσωματιδίων στον υφομύκητα aspergillus nidulans |
| publishDate |
2023 |
| url |
https://hdl.handle.net/10889/25601 |
| work_keys_str_mv |
AT gerostathēsspyros meletētouypokyttarikouentopismoukaitōnantimykētiasikōnidiotētōnpolymerikōnnanosōmatidiōnstonyphomykētaaspergillusnidulans AT gerostathēsspyros antifungaleffectandcellularlocalizationofpolymernanoparticlesinaspergillusnidulans |
| _version_ |
1799945006262255616 |
| spelling |
nemertes-10889-256012023-09-05T04:01:12Z Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού και των αντιμυκητιασικών ιδιοτήτων πολυμερικών νανοσωματιδίων στον υφομύκητα Aspergillus nidulans Antifungal effect and cellular localization of polymer nanoparticles in Aspergillus nidulans Γεροστάθης, Σπύρος Gerostathis, Spyros Υπερδιακλαδισμένα πολυμερή Αντιμυκητιασικά Aspergillus nidulans Ηyperbranched polymers Antifungals Η παρούσα εργασία διερευνά τη χρήση πολυμερικών νανοσωματιδίων πολυ(αιθυλενιμίνης) ως παράγοντες με πιθανές αντιμυκητιασικές ιδιότητες. Η υπόθεση αυτή εργασίας βασίζεται σε πληθώρα βιβλιογραφικών δεδομένων που έχουν υποδείξει τις αντιμικροβιακές ιδιότητες που εκδηλώνουν τα συγκεκριμένα πολυμερή καθώς και παράγωγά τους εναντίον βακτηρίων και άλλων μικροοργανισμών όπως είναι τα άλγη και κάποια είδη μυκήτων. Χρησιμοποιώντας ως πρότυπο μοντέλο τον ευκαιριακά παθογόνο υφομύκητα Aspergillus nidulans, μελετήθηκε η αντιμυκητιασική δράση της υπερδιακλαδισμένης πολυ(αιθυλενιμίνης) (PEI) καθώς και των τροποποιημένων παραγώγων της με ομάδες γουανιδίνης (guanidinylated PEI, GPEI) ή με τεταρτοταγείς αμμωνιακές ομάδες (quaternized PEI, QPEI). Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε ο υποκυτταρικός εντοπισμός των νανοσωματιδίων αυτών σε αναπτυσσόμενες υφές του μύκητα, η επίδρασή τους στην ανάπτυξη των υφών και η ικανότητα τους να προκαλέσουν κυτταρικό θάνατο σε υφές αλλά και σε κονιδιοσπόρια. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός των νανοσωματιδίων πραγματοποιήθηκε μέσω μικροσκοπίας επιφθορισμού και συνεστιακής μικροσκοπίας laser. Μέσω της χρήσης των προαναφερθέντων τεχνικών/προσεγγίσεων, μελετήθηκε η τοξικότητα των νανοσωματιδίων μέσω της χρώσης τους με propidium iodide (PI), ουσίας που αποτελεί δείκτη κυτταρικού θανάτου. Η επίδραση των νανοσωματιδίων στην ανάπτυξη του μύκητα εκτιμήθηκε μέσω δοκιμασιών ανάπτυξης αξιοποιώντας φωτομετρικές μεθόδους (crystal violet microplate assay). Επιπρόσθετα, δεδομένα σχετικά με την τοξικότητα των νανοσωματιδίων αποκτήθηκαν μέσω δοκιμασιών επιβίωσης και συγκεκριμένα μέσω ποσοτικοποίησης της ανάκτησης της αύξησης κονιδιοσπορίων επωασμένων παρουσία των νανοσωματιδίων με τη μέθοδο καταμέτρησης αναπτυσσόμενων αποικιών (Colony formation assay). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα νανοσωματίδια, επισημασμένα με τη φθορίζουσα χρωστική ισοκυανική φθορεσκεΐνη (fluorescein isothiocyanate, FITC), εντοπίζονται αρχικά περιμετρικά της μεμβράνης του μύκητα τόσο στις υφές όσο και στα μη εκβλαστημένα αδρανή κονιδιοσπόρια του, ενώ στη συνέχεια εισέρχονται στο εσωτερικό τους. Ωστόσο, όταν βρίσκονται στον ενδοκυττάριο χώρο δεν φαίνονται να εντοπίζονται σε συγκεκριμένα οργανίδια. Όσον αφορά την επίδρασή τους στην ανάπτυξη του μύκητα, τα νανοσωματίδια εκδηλώνουν κυτταροστατικές ιδιότητες, εμποδίζοντας την εκβλάστηση και κατ’ επέκταση τον σχηματισμό υφών. Από τη σύγκριση μεταξύ των νανοσωματιδίων με διαφορετικές λειτουργικές τερματικές ομάδες εκτιμήθηκαν οι διαφορές στην κυτταροστατική ικανότητα τους, με το PEI να αποτελεί τον πιο ικανό αντιμυκητιασικό παράγοντα καθώς προκαλεί πλήρη αναστολή της ανάπτυξης του μύκητα σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (MIC = 120 nM) από το GPEI (ΜΙC = 210 nM) και το QPEI (ΜΙC = 230 nM). Συνεπώς, οι γουανιδινικές ομάδες φαίνεται να είναι πιο ικανοί αναστολείς της αύξησης των μυκήτων σε σύγκριση με τις τεταρτοταγείς αμινομάδες, ενώ και οι δύο αυτές ομάδες μειώνουν τη δραστικότητα του αρχικού πολυμερούς. Στη συνέχεια, χρώση με τη φθορίζουσα χρωστική PI έδειξε ότι η μεμβράνη των κυττάρων που έχουν αναπτυχθεί παρουσία των νανοσωματιδίων σε συγκεντρώσεις >MIC για επαρκές χρονικό διάστημα (30 - 60 λεπτά) εμφανίζει αυξημένη διαπερατότητα στη χρωστική, συνεπώς έχει διαταραχθεί η ακεραιότητά της προκαλώντας κυτταρικό θάνατο. Η μυκητοκτόνος δράση των νανοσωματιδίων επιβεβαιώθηκε και μέσω της μεθόδου καταμέτρησης αναπτυσσόμενων αποικιών. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου έδειξαν ότι τα κονιδιοσπόρια του μύκητα που έχουν υποστεί κατεργασία με τα νανοσωματίδια εμφανίζουν αδυναμία ανάκτησης αύξησης και συνεπώς η επιβίωση τους μειώνεται μέχρι και 70%. H μυκητοκτόνος δράση των νανοσωματιδίων συγκρίθηκε με αυτή της ιτρακοναζόλης, ενός γνωστού αντιμυκητιασικού φαρμάκου, και τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η δράση των νανοσωματιδίων είναι παρόμοια με αυτή της ιτρακοναζόλης. This work investigates the use of polymeric poly(ethyleneimine) nanoparticles as agents with potential antifungal properties. This hypothesis is based on a plethora of literature data that have indicated the antimicrobial properties exhibited by these polymers as well as their derivatives, against bacteria and other microorganisms such as algae and some fungi. Using the opportunistic pathogen Aspergillus nidulans as a model organism, we studied the antifungal activity of poly(ethyleneimine) (PEI) nanoparticles and its functionalized derivatives guanidinylated PEI (GPEI) and quaternized PEI (QPEI). More specifically, the subcellular localization of these nanoparticles in growing hyphae of the fungus, their effect on fungal growth and their ability to cause cell death in both hyphae and conidiospores were studied. The subcellular localization of the nanoparticles was approached by means of epifluorescence microscopy and laser confocal microscopy. Using the aforementioned techniques, the toxicity of the nanoparticles was studied via propidium iodide (PI) staining, a fluorescent dye that is used as a marker of cell death. The nanoparticles’ effect on fungal growth was evaluated through growth tests utilizing colorimetric methods (crystal violet microplate assay). Additional toxicity data were obtained through survival assays, and more specifically, by quantifying the growth recovery of conidiospores incubated in the presence of the nanoparticles implicating the colony formation assay. The results showed that the nanoparticles, fluorescently labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), are initially localized around the membrane of the fungus both in the hypha and in its quiescent conidiospores, while subsequently entering the cytoplasm. Moreover, when found in the intracellular space they do not appear to be localized in specific organelles. Regarding their effect on the growth of the fungus, the nanoparticles exhibit cytostatic properties preventing germination and, therefore, the formation of hyphae. By comparing the nanoparticles with different functional terminal groups, the differences in their cytostatic ability were assessed, with PEI being the most capable agent causing complete growth inhibition at lower concentrations (MIC = 120 nM) than GPEI (MIC = 210 nM ) and QPEI (MIC = 230 nM). Therefore, guanidinylated amino groups appear to be more potent inhibitors of fungal growth compared to quaternary amino groups, while both functional groups seem to reduce the activity of parent PEI. Subsequently, staining with the fluorescent dye PI showed that the membrane of cells grown in presence of the nanoparticles at concentrations >MIC for a sufficient amount of time (30 - 60 min), exhibits increased permeability to the dye, thus its integrity is disrupted causing cell death. The fungicidal activity of the nanoparticles was also confirmed through the colony formation assay. The results of this approach showed that a significant percentage of fungal conidiospores treated with the nanoparticles exhibited inability to recover growth and therefore their survival was reduced by up to 70%. The fungicidal activity of the nanoparticles was compared with that of itraconazole, a known antifungal drug, and the results indicate that the activity of the nanoparticles is similar to that of itraconazole. 2023-09-04T05:17:07Z 2023-09-04T05:17:07Z 2023-08 https://hdl.handle.net/10889/25601 el application/pdf |
