Δομική βιοχημεία : μελέτη βιολογικών μακρομορίων με στόχο τη βελτίωση φαρμακευτικών σκευασμάτων

• Κύριος συγγραφέας: Αθανασιάδου, Μαρία
• Άλλοι συγγραφείς: Athanasiadou, Maria
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2023
• Θέματα: Κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ; Δομική βιοχημεία; Κρυστάλλωση πρωτεϊνών; Ανθρώπινη ινσουλίνη; Φαινόλη; Φαρμακευτικά πεπτίδια; Σχετική υγρασία; X-ray crystallography; Structural biochemistry; Protein crystallization; Human insulin; Phenol; Pharmaceutical peptides; Relative humidity

Το ερευνητικό μέρος της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας εκπονήθηκε στην ερευνητική ομάδα Βιοχημείας, Δομικής Βιολογίας και Κρυσταλλογραφίας Ακτίνων Χ, του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, του Τμήματος Βιολογίας στο Πανεπιστήμιο Πατρών, κατά το χρονικό διάστημα 2021-2023. Η μελέτη που πραγματεύεται η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία διαχωρίζεται σε τρεις κύριους άξονες. O πρώτος άξονας αφορά την πολυπαραμετρική διερεύνηση του μοριακού και κρυσταλλικού πολυμορφισμού της ανθρώπινης ινσουλίνης παρουσία της φαινόλης ως οργανικού προσδέτη. Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκε η συμπεριφορά της ινσουλίνης σε ένα εύρος βιοχημικών συνθηκών. Τα συμπεράσματα αυτής της μελέτης είναι καίριας σημασίας για την πολυετή προσπάθεια προσδιορισμού φαρμακευτικών μικροκρυσταλλικών σκευασμάτων για την αντιμετώπιση του διαβήτη με βελτιωμένα χαρακτηριστικά φαρμακοκινητικής. Τα πειράματα διενεργήθηκαν τόσο στις εργαστηριακές εγκαταστάσεις όσο και στην Ευρωπαϊκή εγκατάσταση ακτινοβολίας Σύγχροτρον (European Synchrotron Radiation Facility/ ESRF) και συγκεκριμένα στον πειραματικό σταθμό ID22, με την απόκτηση της καλύτερης δυνατής ποιότητας δεδομένων από το ESRF να αναδεικνύει νέες προοπτικές στην επίλυση δομών βιολογικών μακρομορίων μέσω της περίθλασης ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά δείγματα (Χ-ray Powder Diffraction / XRPD). Η εξαιρετικά σημαντική βελτίωση της ευκρίνειας των δεδομένων XRPD έπειτα από την αναβάθμιση του ESRF σε τέταρτης γενιάς κυκλικό επιταχυντή, καθώς και η αξιοποίηση ενός νέου αλγορίθμου επεξεργασίας των δεδομένων στον σταθμό ID22 δημιουργεί νέες προσδοκίες για την αποτελεσματικότερη ανάλυση δεδομένων XRPD, καθώς και για την ακριβέστερη επίλυση δομής με βελτιωμένη ατομική ευκρίνεια. Ο δεύτερος άξονας έρευνας, αφορά στην πραγματοποίηση πειραμάτων κρυστάλλωσης του φαρμακευτικού πεπτιδίου Exenatide, ενός αγωνιστή του υποδοχέα του παρόμοιου με τη γλυκαγόνη πεπτιδίου-1 (GLP-1) που υποβοηθά την αύξηση της παραγωγής ινσουλίνης. Η εργασία αυτή εκπονήθηκε σε συνδυασμό με τη διερεύνηση του κρυσταλλικού πολυμορφισμού της ανθρώπινης ινσουλίνης στα πλαίσια της βελτίωσης των φαρμάκων για την αντιμετώπιση του διαβήτη. Απώτερος στόχος υπήρξε η παραγωγή κρυσταλλικού δείγματος, εφαρμόζοντας διαφορετικά πρωτόκολλα κρυστάλλωσης τόσο για την παραγωγή πολυκρυσταλλικού δείγματος όσο και μονοκρυστάλλων, προκειμένου να αποσαφηνιστεί η δομή και η λειτουργία του πεπτιδίου Exenatide. Σημειώνεται πως έως σήμερα δεν υπάρχουν δομικά μοντέλα κατατεθειμένα στη βάση δεδομένων Protein Data Bank (PDB) για το συγκεκριμένο μόριο από κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Τρίτο άξονα αποτελεί η μελέτη της επίδρασης της σχετικής υγρασίας σε συνδυασμό με τη θερμοκρασία σε πολυκρυσταλλικά δείγματα του φαρμακευτικού πεπτιδίου Octreotide, του οποίου η δομή επιλύθηκε σε υψηλή ευκρίνεια με τη χρήση της τεχνικής Synchrotron XRPD. Η in situ μελέτη του πολυκρυσταλλικού δείγματος Octreotide, επετεύχθη με την πρόσφατη ενίσχυση του εργαστηριακού συστήματος περίθλασης ακτίνων Χ (X’Pert Pro, Malvern Panalytical) μέσω της εγκατάστασης του θαλάμου ελεγχόμενης σχετικής υγρασίας και θερμοκρασίας (Humidity chamber MHC-trans – Anton Paar). Η χρήση του εξοπλισμού επέτρεψε την παρατήρηση της συμπεριφοράς του κρυσταλλικού δείγματος σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες και την ακριβή αναγνώριση των συνθηκών όπου ενδέχεται να παρατηρηθούν αλλαγές στην κρυσταλλική δομή του φαρμακευτικού μορίου, σε πραγματικό χρόνο. Σε κάθε δεδομένη συνθήκη η συλλογή δεδομένων περίθλασης XRPD καθιστά εφικτό τον ακριβή προσδιορισμό βελτιωμένων συνθηκών αποθήκευσης και των ορίων για τη βέλτιστη φαρμακευτική απόδοση, κάτι που είναι πολύ σημαντικό στα πλαίσια του τομέα σχεδιασμού φαρμάκων με βάση τη δομή (Structure Based Drug Discovery/ SBDD).