| Περίληψη: | Η ορθή και απρόσκοπτη διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου εξασφαλίζει την πιστότητα στην αντιγραφή του γενετικού υλικού και τη μεταφορά αμιγώς της γενετικής πληροφορίας στα θυγατρικά κύτταρα. Το κύτταρο διαθέτει μια σειρά από μηχανισμούς ελέγχου που διασφαλίζουν ότι η αντιγραφή του γενετικού υλικού πραγματοποιείται μόνο μια φορά κατά τη διάρκεια της φάσης S και μόνο εφόσον το κύτταρο εξέλθει από τη φάση της μίτωσης. Οποιαδήποτε απορύθμιση στους μηχανισμούς ελέγχου του κυττάρου, μπορεί να οδηγήσει σε γενετική αστάθεια, βασικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Ένα σημαντικό σημείο ελέγχου στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς αποτελεί η μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S. Η μετάβαση αυτή ελέγχεται από το σχηματισμό του προ-αντιγραφικό σύμπλοκο στις αφετηρίες έναρξης της αντιγραφής με σκοπό την ορθή τοπικά και χρονικά έναρξη της αντιγραφής, μέσα από μια διαδικασία που ονομάζεται ‘αδειοδότηση της αντιγραφής’. Ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες του προ-αντιγραφικού συμπλόκου είναι ο Cdt1, που εμφανίζεται εξελικτικά συντηρημένος από το ζυμομύκητα μέχρι τον άνθρωπο. Στους ανώτερους οργανισμούς, ο παράγοντας Cdt1 υφίσταται αυστηρή ρύθμιση κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, ενώ η υπερέκφρασή του δύναται να οδηγήσει σε καρκινική εξαλλαγή, γεγονός που υποδηλώνει τον κεντρικό ρόλο που κατέχει στην αδειοδότηση της αντιγραφής. Πρόσφατα βρέθηκε ο μοριακός αναστολέας του Cdt1, Geminin, ο οποίος πιστεύεται ότι παρέχει ένα επιπρόσθετο επίπεδο ρύθμισης του Cdt1 στους ανώτερους εξελικτικά οργανισμούς. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, το ενδιαφέρον μας εστιάστηκε στη μελέτη του παράγοντα Cdt1, καθώς και του αναστολέα αυτού, Geminin, σε ανθρώπινα κύτταρα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η ρύθμιση που υφίστανται οι ενδογενείς παράγοντες Cdt1 και Geminin κατά την μετάβαση στη φάση ηρεμίας, καθώς και τα επίπεδα έκφρασης τους σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς. Τα πειράματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι παράγοντες Cdt1 και Geminin ελέγχονται σε μεταγραφικό επίπεδο κατά τη μετάβαση από και προς τη φάση ηρεμίας G0, αφού τα επίπεδα της πρωτεΐνης και του mRNA τους μειώνονται αισθητά κατά τη μετάβαση στη φάση ηρεμίας και συσσωρεύονται σταδιακά κατά την επαναφορά στον κυτταρικό κύκλο. Επιπλέον, οι παράγοντες Cdt1 και Geminin βρέθηκαν να υπερεκφράζονται σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς που εξετάστηκαν σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυσιολογικά δείγματα. Εν συνεχεία η μελέτη προσανατολίστηκε στη διερεύνηση του τρόπου δράσης του παράγοντα Cdt1 στη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής in vivo, με χρήση σύγχρονων τεχνικών μικροσκοπίας σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα σε καλλιέργεια. Για τις μελέτες αυτές δημιουργήθηκε σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά που εκφράζει την πρωτεΐνη Cdt1 σε σύντηξη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεϊνη GFP (Cdt1GFP)σε φυσιολογικά επίπεδα. Πειράματα ανοσοφθορισμού και πειράματα μικροσκοπίας time-lapse έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1GFP συμπεριφέρεται όπως η ενδογενής τόσο ως προς τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της, όσο και ως προς τη ρύθμιση κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η κύρια μορφή ρύθμισης του παράγοντα Cdt1 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου λαμβάνει χώρα σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο και ότι η σύντηξη με την GFP δε φαίνεται να επηρεάζει τη ρύθμιση αυτή. Πειράματα Επαναφοράς Φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση (FRAP) σε ζωντανά κύτταρα έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1GFP διαχέεται ελεύθερα κατά το μεγαλύτερο μέρος της μίτωσης, ενώ η αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη αρχίζει στη φάση της τελόφασης και συνεχίζεται μέχρι και το τέλος της φάσης G1. Η πρόσδεση του παράγοντα Cdt1 στη χρωματίνη έχει ιδιαίτερα δυναμικό χαρακτήρα, υποδηλώνοντας ότι η δημιουργία του προ-αντιγραφικού συμπλόκου δεν είναι στατική, αλλά επαναπροσδιορίζεται καθ’ όλη τη διάρκεια της φάσης G1. Πειράματα FRAP σε ζωντανά κύτταρα που εξέφραζαν μεταλλαγμένες μορφές του παράγοντα Cdt1 επιπλέον επέτρεψαν την in vivo χαρτογράφηση των περιοχών που χρειάζονται για τη δέσμευση του παράγοντα στη χρωματίνη και κατέδειξαν το αμινοτελικό άκρο και τη θηλιά 2 ως περιοχές απαραίτητες για τη δέσμευση του παράγοντα στη χρωματίνη. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι περιοχές που συμβάλλουν στην κύρια αλληλεπίδραση με τη Geminin, δεν συμβάλλουν στη δέσμευση του παράγοντα Cdt1 με τη χρωματίνη, σε αντίθεση με ότι είχε προταθεί από in vitro πειράματα. Με σκοπό να ανιχνεύσουμε αλληλεπίδραση του παράγοντα Cdt1 με τον αναστολέα αυτού Geminin σε συγκεκριμένο χώρο και χρόνο σε ζωντανά κύτταρα εφαρμόσαμε μικροσκοπία FLIM. Ειδική αλληλεπίδραση ανιχνεύθηκε σε όλο τον πυρήνα. Αντίθετα, μια μορφή της Geminin μεταλλαγμένη στην περιοχή επαφής με το Cdt1 εμφάνισε σαφώς μειωμένη ικανότητα αλληλεπίδρασης. Ποσοτικοποίηση της αλληλεπίδρασης με μικροσκοπία FLIM επέτρεψε την εκτίμηση της σχετικής συνάφειας (affinity) των δύο βιομορίων στο ζωντανό κύτταρο Πειράματα FRAP υποδηλώνουν ότι η παρουσία της Geminin δεν επηρεάζει τη δέσμευση του Cdt1 στη χρωματίνη. Αντίθετα, ο Cdt1 προσελκύει τη Geminin στη χρωματίνη και επομένως η αναστολή της αδειοδότησης της αντιγραφής πραγματοποιείται στη χρωματίνη. Τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας παρέχουν μια νέα εικόνα του τρόπου με τον οποίο πραγματοποιείται η διαδικασία της αδειοδότηση της αντιγραφής φυσιολογικά καθώς και πώς θα μπορούσε να ανασταλεί η διαδικασία αυτή in vivo.
|
|---|
