| Περίληψη: | Το ασβέστιο αποτελεί ένα σημαντικό δεύτερο μήνυμα που ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση. Η αύξηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου αυξάνει την παραγωγή της IL-10 στα Τ-λεμφοκύτταρα, αλλά δεν είναι σαφές ποια ενδοκυττάρια μόρια εμπλέκονται σε αυτή τη ρύθμιση. Σκοπός της μελέτης είναι η αποσαφήνιση της συμμετοχής του ασβεστίου στην παραγωγή της IL-10 από Τ-λεμφοκύτταρα και η εντόπιση των πιθανών ενδοκυττάριων στόχων.
Ο ρόλος των ενζύμων κλειδιών στην οδό ενεργοποίησης μέσω ασβεστίου καλσινευρίνης και CaM Kinase II μελετήθηκε με χρήση είτε ειδικών αναστολέων, κυκλοσπορίνης και ΚΝ-62 αντίστοιχα, είτε με πλασμίδια που κωδικοποιούν τις καταλυτικές υπομονάδες των ενζύμων καλσινευρίνη και CaM Kinase II.
Ανθρώπινα Τ-λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος διεγέρθηκαν με anti-CD3/anti-CD28 (διέγερση μέσω TCR), ή Ionomycin/PMA (ενδοκυττάρια στόχευση Ca++ και PKC) παρουσία ή απουσία των ειδικών αναστολέων. Το πρωτεϊνικό προϊόν της IL-10 μετρήθηκε με ELISA ενώ η παραγωγή mRNA της IL-10 με Real Time PCR. Η ενεργότητα του υποκινητή της IL-10, IL-2, IL-4 παρουσία ή απουσία των ενεργών ενζύμων ελέγχθηκε με διαμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδια που φέρουν τον υποκινητή του γονιδίου (1327 bp) ή τμήματα αυτού (-1010, -500, -310, -235, -135 bp
Η δράση των ίδιων ενζύμων στην ενεργότητα των μεταγραφικών παραγόντων MEF2, CREB και NF-κB ελέγχθηκε με ταυτόχρονη έκφρασή τους in vivo με πειράματα διαμολύνσεως με πλασμίδια που ελέγχουν την ενεργότητα της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο τους και in vitro σε πυρηνικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα με πειράματα EMSA. Η επίδραση του μεταγραφικού παράγοντα MEF2 στον υποκινητή της IL-10 έγινε μέσω υπερέκφρασης του in vivo σε πειράματα διαμόλυνσης.
Η IL-10 ανιχνεύεται 24 ώρες μετά τη διέγερση των κυττάρων, φτάνει στο μέγιστο στις 48 ώρες και μειώνεται μετά τις 72 ώρες. Παρουσία κυκλοσπορίνης η παραγωγή της IL-10 μειώθηκε κατά 80%-100%, ενώ παρουσία ΚΝ-62 η παραγωγή της IL-10 μειώθηκε κατά 70%-90%, σε όλα τα χρονικά διαστήματα στα οποία μελετήθηκε. Τα ποσοστά αναστoλής ήταν ίδια και κατά τους δύο τρόπους διέγερσης. Οταν τα κύτταρα διεγέρθηκαν μέσω TCR και του συνδιεγερτικού μορίου CD28, η αναστολή των παραπάνω ενζύμων δεν επηρεάζει την συσσώρευση του mRNA της IL-10, υποδηλώνοντας ότι η ρύθμιση γίνεται σε μεταγενέστερα της μεταγραφής στάδια, επηρεάζοντας πιθανά τη σταθερότητα του mRNA ή το ρυθμό μετάφρασής του. Όταν ο τρόπος διέγερσης των κυττάρων παρέκαμπτε τον TCR τότε η ελάττωση της παραγωγής της IL-10 αντανακλούσε και σε επίπεδο mRNA.
Η ενεργοποίηση του υποκινητή της IL-10 που παρατηρείται μετά από διέγερση με ΙON/PMA και CD3/CD28 αυξήθηκε κατά 5 και 3 φορές αντίστοιχα σε Τ λεμφοκύτταρα τα οποία είχαν διαμολυνθεί με τις ενεργές μορφές των ενζύμων καλσινευρίνη και CaM Kinase II σε σχέση με τα κύτταρα τα οποία είχαν διαμολυνθεί μόνο με το όχημα pSRa. Η δράση της CaM Kinase II είναι εκλεκτική για τον υποκινητή της ΙL-10 εφόσον το ίδιο ένζυμο μειώνει την δραστικότητα του υποκινητή τόσο μιας άλλης Th2 κυτταροκίνης όπως η IL-4 όπως επίσης και της IL-2, ενώ η καλσινευρίνη έχει θετική επίδραση στους υποκινητές και των τριων κυτταροκινών.
Το τμήμα του υποκινητή της IL-10 που επηρεάζεται από τα προαναφερθέντα ένζυμα καλσινευρίνη και CaM Kinase II βρίσκεται στις πρώτες 500 bp πριν το TATA box, και περιέχει σημεία πρόσδεσης των μεταγραφικών παραγόντων MEF-2, CREB και NFκΒ όπως ελέγχθηκε με το πρόγραμμα Consite. Η in vitro δραστικότητα του MEF-2 σε πυρηνικά εκχυλίσματα διεγερμένων Τ-λεμφοκυττάρων μειώθηκε κατά 50% παρουσία των αναστολέων της καλσινευρίνης και της CaM Kinase II ενώ η ενεργότητα του αυξήθηκε μετά από υπερέκφραση της CaM Kinase II. Αντίθετα η ενεργότητα τόσο του μεταγραφικού παράγοντα CREB όσο και του NFκB μειώθηκε παρουσία της CaM Kinase II, γεγονός που υποδεικνύει τον MEF2 ως ενδοκυττάριο στόχο της ασβεστιοεξαρτώμενης οδού ενεργοποίησης στη ρύθμιση της παραγωγής της IL-10 από ανθρώπινα T λεμφοκύτταρα. Το γεγονός ότι η υπερέκφραση του MEF2D σε Τ-λεμφοκύτταρα αύξησε την ενεργότητα του υποκινητή της IL-10 αποδεικνύει ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας στη ρύθμιση της παραγωγής της.
|
|---|
