| Περίληψη: | Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης ανήκει στην υπερ-οικογένεια των ιοντικών διάυλων ενεργοποιούμενων μέσω προσδέτη (ligand-gated ion channels). Οι υπομονάδες των υποδοχέων που ανήκουν στην οικογένεια αυτή, φέρουν στο αμινοτελικό τους άκρο τη χαρακτηριστική κυστεϊνική θηλιά (Cys-loop) μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης, οι οποίες συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό. Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι μεγάλες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες και χωρίζονται σε δυο κατηγορίες, τους νευρικούς και τους μυϊκούς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, καθώς και σε μη-νευρικούς ιστούς, όπως τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Επιπλέον, χωρίζονται σε δύο υποκατηγορίες, τους ετεροπενταμερείς, όπως είναι η (α4)x(β2)y, και τους ομοπενταμερείς, όπως η (α7)5. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών και εμφανίζουν στοιχειομετρία (α1)2β1γδ (στα έμβρυα) ή (α1)2β1εδ (στους ενήλικες).
Ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης σε σχέση με τα υπόλοιπα μέλη της υπερ-οικογένειας, είναι ο καλύτερα μελετημένος ως προς τα χαρακτηριστικά και τη λειτουργία του. Ένας από τους κύριους παράγοντες που συνέβαλε στον εκτεταμένο χαρακτηρισμό του μυϊκού υποδοχέα είναι η δυνατότητα απομόνωσης, σε μεγάλες ποσότητες και σε λειτουργική μορφή, υποδοχέων της ακετυλοχολίνης παρόμοιων με αυτούς της νευρομυϊκής σύναψης από τα ηλεκτρικά όργανα των ψαριών Torpedo και Electrophorus. Οι πρώτες πληροφορίες για την τρισδιάστατη δομή του υποδοχέα δόθηκαν από ένα μοντέλο ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, από υποδοχέα που απομονώθηκε από το ηλεκτρικό όργανο του ψαριού Torpedo marmorata. Στη συνέχεια, η λύση της δομής ενός ομολόγου του εξωκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα, της acetylcholine binding protein (AChBP) από το σαλιγκάρι Lymnaea stagnalis έφερε και τις πρώτες πληροφορίες υψηλής ανάλυσης. Η AChBP είναι μια υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη, η οποία σχηματίζει σταθερά ομοπενταμερή, με ομολογία 20%-24% με το εξωκυτταρικό τμήμα των υπομονάδων του υποδοχέα. Πρόσφατα, η λύση της δομής της εξωκυτταρικής περιοχής της α1 υπομονάδας του υποδοχέα ποντικού, στην οποία είχε προσδεθεί ο ανταγωνιστής της ακετυλοχολίνης α-μπουγκαροτοξίνη, προσέφερε επιπλέον πληροφορίες για τα χαρακτηριστικά του υποδοχέα, όπως είναι η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR) και η συντηρημένη Cys-loop περιοχή. Παρόλα αυτά δεν έχουν δημοσιευτεί υψηλής ανάλυσης πληροφορίες για τη δομή του ανθρώπινου υποδοχέα.
Επιπλέον από το φυσιολογικό ρόλο του μυϊκού υποδοχέα, ο οποίος είναι άμεσα υπεύθυνος για τη διαβίβαση της ώσης στη νευρομυϊκή σύναψη, παράλληλα ο υποδοχέας αυτός αποτελεί και στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, στα οποία ανήκει και το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στη νόσο αυτή, αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα προκαλούν μείωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη με συνέπεια να παρεμποδίζεται η δράση της ακετυλοχολίνης. Αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης εντοπίζονται στο 80%-90% των μυασθενών και η παρουσία τους θεωρείται ο κύριος παθογόνος παράγοντας για τη μυασθένεια.
Ο σημαντικός ρόλος λοιπόν του υποδοχέα σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, τον καθιστά αντικείμενο εντατικής έρευνας. Η λεπτομερής ανάλυση της δομής και της λειτουργίας του θα μπορούσε να συμβάλλει στην κατανόηση της δομής και της λειτουργίας των υπόλοιπων υποδοχέων-μελών της υπερ-οικογένειας καθώς επίσης και στην εξιχνίαση του αυτοάνοσου μηχανισμού της μυασθένειας. Ωστόσο, το μεγάλο μέγεθος του μορίου του υποδοχέα, ο υδρόφοβος χαρακτήρας του και η αδυναμία απομόνωσής του από φυσικές πηγές, δυσχεραίνει την πραγματοποίηση δομικών μελετών. Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο να προκύψουν πρωτεϊνικά μόρια με δομή η οποία να πλησιάζει αρκετά τη φυσική διαμόρφωση του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης και σε ποσότητες ικανές ώστε να είναι εφικτές οι δομικές μελέτες τους.
Προηγούμενα, είχαν εκφραστεί στο εργαστήριό μας οι εξωκυτταρικές περιοχές (ΕΚΠ) των υπομονάδων α1, β1, γ και ε (α1ΕΚΠ, β1ΕΚΠ, γΕΚΠ και εΕΚΠ) του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα, χρησιμοποιώντας ως σύστημα έκφρασης το ζυμομύκητα Pichia pastoris. Οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, απομονώθηκαν σε διαλυτή και γλυκοζυλιωμένη μορφή, αναγνωρίζονταν από μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της κάθε υπομονάδας, αλλά και από αντισώματα προερχόμενα από ορούς μυασθενών. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα δεν ήταν ικανοποιητικά για δομικές μελέτες. Παρόλα αυτά, οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς για μια καινούρια αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, η οποία έγκειται στην ειδική αφαίρεση των αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, χρησιμοποιώντας τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες ως ανοσοπροσροφητές. Η χρήση της α1ΕΚΠ του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητή, είχε ως αποτέλεσμα την αφαίρεση μεγάλου ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα με τη χρήση των εξωκυτταρικών τμημάτων των υπομονάδων β1, γ και ε ως ανοσοπροσροφητές. Ωστόσο, με τον τρόπο αυτό δεν επιτυγχάνεται πλήρης απομάκρυνση των παθογόνων αυτοαντισωμάτων.
Η παρούσα εργασία είχε στόχο τη βελτίωση της δομής, της διαλυτότητας και των επιπέδων έκφρασης των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, έτσι ώστε να είναι κατάλληλες για δομικές μελέτες και κυρίως για να συμβάλλουν στις προσπάθειες βελτίωσης της αντιγονοειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια. Ειδικότερα, το πρώτο μέρος αφορά μελέτες σχετικές με την έκφραση της γΕΚΠ, η οποία σχημάτιζε ολιγομερή και είχε πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Σχεδιάστηκαν λοιπόν 4 μεταλλάγματα, με την προοπτική να προκύψουν πιο διαλυτά και υδρόφιλα μόρια. Οι μεταλλάξεις που σχεδιάστηκαν αφορούσαν στην αντικατάσταση συγκεκριμένων κυστεϊνών, που θα μπορούσαν να σχηματίζουν ακατάλληλους ένδο- ή δια-μοριακούς δεσμούς (μέσω δισουλφιδικών δεσμών), καθώς επίσης και στην αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής με την αντίστοιχη, πιο υδρόφιλη της AChBP. Στα δύο μεταλλάγματα που έφεραν τη Cys-loop περιοχή της AChBP, παρατηρήθηκε δραματική βελτίωση στα επίπεδα έκφρασης και στη διαλυτότητα των μορίων, ενώ ακόμη προσεγγίστηκε το αναμενόμενο μοριακό μέγεθος, όπως φανέρωσαν τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης καθώς και οι μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός. Όταν τα δύο βελτιωμένα μεταλλάγματα χρησιμοποιήθηκαν ως ανοσοπροσροφητές για την αντιγονοειδική θεραπεία που προαναφέρθηκε, παρουσίασαν βελτιωμένη ικανότητα πρόσδεσης αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, συγκριτικά με την αγρίου τύπου γΕΚΠ. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι η υδρόφοβη Cys-loop περιοχή της αγρίου τύπου γΕΚΠ συμβάλλει σημαντικά στη δημιουργία συσσωματωμάτων κατά την έκφραση της ΕΚΠ και για το λόγο αυτό ακολούθησε η αντικατάσταση αυτής της περιοχής και στις υπόλοιπες ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα.
Προκειμένου να βελτιωθεί περαιτέρω η αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες να συνεκφραστούν όλες οι ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, με σκοπό να δημιουργηθούν σύμπλοκα που διαθέτουν και τις διεπιφάνειες μεταξύ των ΕΚΠ του υποδοχέα, οι οποίες πιστεύεται ότι είναι και αυτές ανοσογόνες. Στις προσπάθειες αυτές χρησιμοποιήθηκαν οι μεταλλαγμένες ΕΚΠ των υπομονάδων που φέρουν τη Cys-loop περιοχή της AChBP.
Οι αρχικές συνεκφράσεις των ΕΚΠ όλων των υπομονάδων του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ήταν ανεπιτυχείς όσον αφορά στη δημιουργία συμπλόκων. Προκειμένου λοιπόν, να πραγματοποιηθεί ο συνδυασμός όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων και η δημιουργία ενός λειτουργικού μορίου, το επόμενο βήμα ήταν η σύνδεση των υπομονάδων με ένα πεπτιδικό συνδέτη επαναλαμβανόμενων αμινοξέων. Ο συνδέτης που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από οκτώ επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)8. Αρχικά κατασκευάστηκαν όλα τα ζεύγη (συγκαταμερή) που χρειάζονται, για να επακολουθήσουν πολλαπλά στάδια υποκλωνοποιήσεων, προκειμένου να σχηματιστεί το πενταμερές.
Όλα τα συγκαταμερή παρουσίασαν το αναμενόμενο μοριακό βάρος όπως φάνηκε από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE), γεγονός που σημαίνει ότι ο συνδέτης δεν πρωτεολύεται και είναι ικανός να συγκρατεί τις υπομονάδες ενωμένες. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης που παρουσίασαν τα συγκαταμερή ήταν ικανοποιητικά και όλα τα συγκαταμερή που έφεραν την α1ΕΚΠ διατήρησαν την ικανότητα να προσδένουν σημασμένη α-μπουγκαροτοξίνη, η οποία προσδένεται ειδικά στην α1ΕΚΠ με υψηλή συγγένεια. Ωστόσο, τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης, φανέρωσαν ότι όλα τα συγκαταμερή εκλούονται δίνοντας ένα ευρύ φάσμα μοριακών βαρών, από μονομερή μέχρι ολιγομερή και συσσωματώματα. Τέλος, η α1ΕΚΠ-(AGS)8-γΕΚΠ παρουσίασε αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης 125Ι-α-Βgt συγκριτικά με την γΕΚΠ-(AGS)8-α1ΕΚΠ, γεγονός που σημαίνει ότι η σειρά με την οποία συνδέονται οι υπομονάδες, παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση των μορίων. Στην προσπάθεια βελτίωσης της διαμόρφωσης και των χαρακτηριστικών των συγκαταμερών, έγινε χρήση ενός μεγαλύτερου συνδέτη, αποτελούμενου από έντεκα επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)11, ωστόσο δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα τελικά προϊόντα έκφρασης.
Όσον αφορά στη χρήση των συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα συγκαταμερή διατήρησαν πλήρως την ικανότητα να προσδένουν αυτοαντισώματα από τους ορούς των μυασθενών, αν και δε βελτίωναν περαιτέρω την ικανότητα ανοσοπροσρόφησης των επιμέρους ΕΚΠ.
Συμπερασματικά λοιπόν, καταλήγουμε ότι η αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής των ΕΚΠ των υπομονάδων με την αντίστοιχη, υδρόφιλη περιοχή του ομολόγου AChBP, οδηγεί στη δημιουργία μορίων με βελτιωμένα χαρακτηριστικά, όπως είναι τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα των μορίων. Τα μόρια αυτά μπορούν στη συνέχεια να συνδεθούν με ένα πεπτιδικό συνδέτη και να παραχθούν συγκαταμερή με σωστή διαμόρφωση, τα οποία διατηρούν τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τους, όπως είναι η πρόσδεση σημασμένης α-μπουγκαροτοξίνης και η πρόσδεση αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν την πεποίθηση ότι είναι εφικτή η κατασκευή του ετεροπενταμερούς του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα που θα αποτελείται μόνο από τις ΕΚΠ των υπομονάδων του.
|
|---|
