| Περίληψη: | Η ολοκληρωμένη εκτίμηση της θειολικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης (ΘΟΚ) ενός οργανισμού ιστού ή κυττάρου είναι πολύ σημαντική καθώς οξειδοαναγωγικές αλλαγές των διαφόρων θειολικών μορίων συνδέονται με το οξειδωτικό στρες και με αρκετές ασθένειες. Η γενική ΘΟΚ (ΓΘΟΚ) χαρακτηρίζεται από τις συγκεντρώσεις ορισμένων συνόλων θειολικών μορίων στην αναγμένη και την οξειδωμένη μορφή τους (θειολικά οξειδοαναγωγικά ζεύγη). Αυτά τα ζεύγη μπορεί να είναι μη πρωτεϊνικά (non-protein ή NP) (όπως NPSH και NPSSNP με το NP να συμβολίζει οποιαδήποτε άλλη μη πρωτεϊνική θειόλη) ή πρωτεϊνικά (protein ή P) (όπως PSH, PSSP και PSSNP). Ειδικότερα, οι κυριότερες μη πρωτεϊνικές θειόλες γλουταθειόνη (GSH) και κυστεΐνη (CSH) μαζί με τα συμμετρικά, μεικτά δισουλφίδιά τους και τις οξειδωμένες τους μορφές (GSSG, PSSG, PSSC, NPGSHox, NPCSHox,) είναι τα οξειδοαναγωγικά ζεύγη τα οποία χαρακτηρίζουν την ειδική ΘΟΚ (ΕΘΟΚ), καθώς είναι εκείνα που απαντώνται σε υψηλότερη συγκέντρωση στους οργανισμούς. Στη διεθνή βιβλιογραφία δεν υπάρχει μεθοδολογία για την ταυτόχρονη ποσοτικοποίηση των θειολικών μορίων που χαρακτηρίζουν τη ΘΟΚ των οργανισμών. Συνεπώς, στόχος της παρούσας μελέτης είναι η ανάπτυξη μιας νέας μεθόδου ποσοτικοποίησης τόσο της ΓΘΟΚ όσο και της ΕΘΟΚ, που να είναι εφαρμόσιμη σε όλους τους οργανισμούς. Για το διαχωρισμό πρωτεϊνικών και μη πρωτεϊνικών μορίων χρησιμοποιήθηκε το τριχλωροακετικό οξύ που σε ορισμένη συγκέντρωση (>5%) καταβυθίζει αποτελεσματικά όλες τις πρωτεΐνες. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των δισουλφιδικών μορίων και οξειδωμένων μορφών (NPSSNP, PSSP, PSSNP, GSSG, NPGSHox, NPCSHox, PSSG και PSSC) πραγματοποιήθηκε μετά από αναγωγή τους (με το αντιδραστήριο tributyl phosphine), ενώ ο ποσοτικός προσδιορισμός των ελεύθερων θειολών (PSH, NPSH, GSH και CSH) πραγματοποιήθηκε χωρίς την αναγωγή τους. Ειδικότερα, η ποσοτικοποίηση των αναγμένων διθειολικών ομάδων (δισουλφιδίων) και των ελεύθερων θειολών έγιναν με τα αντιδραστήρια 4,4-dithiodipyridine (για τις -SH ομάδες των αναγμένων δισουλφιδίων, καθώς και για τις ελεύθερες NPSH και PSH), o-phthalaldehyde (για την GSH, GSSG και NPGSHox) και νινυδρίνη (για την CSH και την NPCSHox), σε συνδυασμό με κατάλληλη μαθηματική επεξεργασία βασισμένη στη στοιχειομετρία των αντιδράσεων αναγωγής. Η υψηλή ευαισθησία της μεθόδου (στο επίπεδο του nmol) την καθιστά εφαρμόσιμη ακόμη και σε βιολογικά δείγματα χαμηλής περιεκτικότητας σε θειόλες (όπως πχ. το οφθαλμικό και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό).
|
|---|
