Έκφραση, απομόνωση και χαρακτηρισμός της εξωκυτταρικής περιοχής της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης

• Κύριος συγγραφέας: Γεωργοστάθη, Ασημίνα
• Άλλοι συγγραφείς: Τζάρτος, Σωκράτης
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2010
• Θέματα: Υποδοχέας ακετυλοχολίνης; Μυασθένειες; Acetylcholine receptors (AChR); Myasthenia gravis (MG); 612.814

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs), μέλη της υπερ-οικογένειας των πενταμερών χημειοελεγχόμενων ιοντικών καναλιών (LGICs), είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες μεγέθους ~290 kDa. Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά, διακρίνονται σε μυϊκού και νευρικού τύπου υποδοχείς. Οι μυϊκού τύπου nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα των ιχθύων Torpedo sp. και στις νευρομυϊκές συνάψεις των σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μύες. Αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες που σχηματίζουν ένα κανάλι, με στοιχειομετρία (α1)2βγδ στα έμβρυα ή (α1)2βεδ στους ενήλικες. Κάθε υπομονάδα αποτελείται από: (α) ένα αμινο-τελικό εξωκυτταρικό τμήμα (ECD) μήκους ~210–220 αμινοξέων (β) τέσσερις μικρές (15–20 αμινοξέα μήκος η καθεμιά) υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές (M1–M4) και δύο μικρές υδρόφοβες θηλιές, μεταξύ των M1–M2 και M2–M3 (γ) μια υδρόφιλη κυταρροπλασματική θηλιά που ποικίλει σε μέγεθος (100–150 κατάλοιπα) και αμινοξική σύσταση μεταξύ των υπομονάδων, ανάμεσα στην Μ3 και Μ4 περιοχή, και (δ) ένα μικρό (4–28 αμινοξέα) υδρόφιλο καρβοξυ-τελικό άκρο εξωκυτταρικά. Οι μυϊκού τύπου nAChRs εκτός από την φυσιολογική τους δράση εμπλέκονται και στην αυτοάνοση νόσο μυασθένεια (myasthenia gravis-MG). Τα αυτοαντισώματα των μυασθενικών προσδένονται στην εξωκυτταρική περιοχή του AChR και η πλειοψηφία τους φαίνεται να στοχεύει την α1 υπομονάδα και συγκεκριμένα την κύρια ανοσογόνο περιοχή της-MIR. Επιπλέον, στην εξωκυτταρική περιοχή της α1 υπομονάδας εντοπίζεται και η περιοχή που συμμετέχει στον σχηματισμό της θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και άλλων χολινεργικών προσδετών. Το α1 ECD του ανθρώπινου nAChRs έχει ήδη εκφραστεί, απομονωθεί και χαρακτηριστεί από υπερκείμενο καλλιέργειας του ζυμομύκητα Pichia pastoris ως μονομερές, υδατοδιαλυτό και λειτουργικό πρωτεϊνικό μόριο. Η ικανότητά του να προσδένει αντι-AChR αυτοαντισώματα βρέθηκε μέτρια, και για τον λόγο αυτό στην παρούσα εργασία εκφράστηκε σε ένα ανώτερο εξελικτικά σύστημα από αυτό του Pichia pastoris, με σκοπό την έκφραση μορίων με καλύτερη αναδίπλωση, που να προσομοιάζουν περισσότερο με την φυσική τους διαμόρφωση, καθώς επίσης και την παραγωγή ικανοποιητικής ποσότητας πρωτεΐνης, ώστε να είναι εφικτή η δομική της μελέτη. Ως ετερόλογο σύστημα έκφρασης, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα εντόμων του είδους Trichoplusia ni (High Five), τα οποία ήταν σταθερά μετασχηματισμένα ως προς το ανασυνδιασμένο α1 ECD πολυπεπτίδιο. Αναλυτικότερα, το ECD της α1 υπομονάδας εκφράστηκε στα δύο συστήματα και στην συνέχεια καθαρίστηκε και απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας και μοριακής διήθησης. Το High Five α1 ECD εκφράστηκε ως υδατοδιαλυτό μόριο σε ικανοποιητική ποσότητα ενώ η χρωματογραφία μοριακής διήθησης και οι μελέτες δυναμικής σκέδασης του φωτός έδειξαν επιπλέον πως εκφράζεται ως μονομερές. Ορισμένοι χολινεργικοί προσδέτες προσδένονται στο High Five α1 ECD, επιβεβαιώνοντας πως η διαμόρφωσή του προσομοιάζει με του ανθρώπινου nAChR. Με πειράματα ELISA και ραδιοανοσολογικού προσδιορισμού, προέκυψε πως το High Five α1 ECD δεσμεύει μεγαλύτερο ποσοστό αντι-nAChR μονοκλωνικών αντισωμάτων και αυτοαντισωμάτων από τον ορό μυασθενικών, συγκριτικά με το Pichia pastoris α1 ECD. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής, το ανασυνδυασμένο α1 ECD του ανθρώπινου nAChR, εκφρασμένο σε κύτταρα εντόμων High Five, προσομοιάζει περισσότερο με την φυσική διαμόρφωση του nAChR. Επιπλέον, το ετερόλογο σύστημα έκφρασης των High Five κυττάρων είναι αποδοτικά καλύτερο σε σύγκριση με αυτό του ζυμομύκητα Pichia pastoris. Αυτό, καθιστά το High Five α1 ECD καταλληλότερο για δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, που θα βοηθήσουν στην επίλυση της τρισδιάστατης δομής του υποδοχέα, αλλά και για την ανάπτυξη μιας ειδικής αντιγονοειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια.