Bone morphogenetic protein (BMP-7) και μοριακά δίκτυα δυνητικών stem κυττάρων στον νεφρό

• Κύριος συγγραφέας: Τρίγκα, Κωνσταντίνα
• Άλλοι συγγραφείς: Σωτηροπούλου-Μπονίκου, Γεωργία
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2011
• Θέματα: Νεφρός; BMP-7; Kidney; 616.994 61

Η BMP-7 αποτελεί μόριο κλειδί κατά την εμβρυογένεση στον νεφρό, ενώ μετέπειτα, θεωρείται νεφροπροστατευτικός παράγων. Ο νεφρός χαρακτηρίζεται από μία μοναδική πλαστικότητα μεταξύ επιθηλιακών και μεσεγχυματικών κυττάρων. Κατά την ανάπτυξη του Νεφρού, το επιθήλιο του νεφρώνα δημιουργείται μέσω της διαδικασίας της Μεσεγχυματικής προς Επιθηλιακή μετάβαση (ΜΕΤ – Mesenchymal Epithelial Transition). Στην διαδικασία αυτή καθοριστικό ρόλο παίζει η BMP-7. Η αντίστροφη διαδικασία - Επιθηλιακή προς Μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ), συμβάλλει, μετά από νεφρική βλάβη στον ενήλικο νεφρό, στην δημιουργία μεσεγχυματικών κυττάρων – ινοβλαστών με δυνητικά τελικό αποτέλεσμα νεφρική ίνωση που εκδηλώνεται κλινικά ως νεφρική ανεπάρκεια. Εκτός από την ιστική αντίδραση μετά από βλάβη, οι διαδικασίες ΕΜΤ και ΜΕΤ ενέχονται ενεργά στην καρκινογένεση και την διαδικασία της μετάστασης. Τα Stem (βλαστικά) κύτταρα συμμετέχουν στην ομοιόσταση των ιστών, αλλά και στην ιστική επανόρθωση-αποκατάσταση μετά από βλάβη. Κύτταρα με τις μοναδικές ιδιότητες των stem κυττάρων (αυτο-ανανέωση και πολυδυναμία), επίσης εμπλέκονται στις διαδικασίες της καρκινογένεσης και μετάστασης. Οι μοναδικές αυτές ιδιότητες των stem κυττάρων καθορίζονται από μοριακά δίκτυα στα οποία πρωταγωνιστικό ρόλο παίζουν οι μεταγραφικοί παράγοντες Oct4 Sox2 και Nanog, οι πρωτεϊνες της ομάδας Polycomb όπου ανήκει ο EZH2, και microRNAs. Η σηματοδοτική οδός της ΒΜΡ συμμετέχει δραστικά κατά τον επαναπρογραμματισμό ωρίμων σωματικών κυττάρων σε κύτταρα με ιδιότητες stem κυττάρων (iPS). Στον νεφρό, πρόσφατα, έχουν αναγνωρισθεί θέσεις δυνητικών stem κυττάρων.Τελευταίες μελέτες εισηγούνται την συμμετοχή stem κυττάρων κατά την αποκατάσταση της νεφρικής βλάβης και την κυτταρική αναγέννηση στον νεφρό, ενώ τα ακριβή μοριακά γεγονότα, κατά την σημαντικότατη και από κλινικής πλευράς διαδικασία αυτή, απομένουν να διευκρινισθούν. Το θέμα stem κύτταρα και νεφρός αποτελεί ένα ανοικτό προς διερεύνηση, κλινικά πολλά υποσχόμενο πεδίο. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε με μορφολογική (ανοσοϊστοχημική) μέθοδο σε νεφρικό ιστό in situ, η πιθανή συσχέτιση μορίων της σηματοδοτικής οδού ΒΜΡ, με γνωστούς παράγοντες κλειδί σε μοριακά δίκτυα stem κυττάρων. Χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα για τον νεφροπροστατευτικό παράγοντα ΒΜΡ7, τον υποδοχέα ΒΜΡR1B και τον ανταγωνιστή της ΒΜΡ7 γκρεμλίνη. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης αντισώματα για τους μεταγραφικούς παράγοντες Oct4 και Sox2, για τον παράγοντα της ομάδας Polycomb EZH2, ο οποίος συμμετέχει στην επιγενετική ρύθμιση της μεταγραφής και για ένα γνωστό δείκτη stem κυττάρων την αλδεϋδική δεϋδρογενάση ALDH1, η οποία σχετίζεται με τον καθοριστικό για την τύχη των stem κυττάρων παράγοντα ρετινοϊκό οξύ. Τα ιστικά δείγματα προήλθαν από 49 ασθενείς (30 άνδρες,19 γυναίκες), ηλικίας από 50 έως 79 ετών. Η ανοσοϊστοχημική μέθοδος εφαρμόσθηκε σε εγχειρητικό υλικό νεφρεκτομής λόγω Διαυγοκυτταρικού Καρκινώματος του Νεφρού. Στο υλικό αυτό ανευρίσκεται τόσο η νεοπλασματική μάζα, αλλά και ο παρακείμενος του νεοπλάσματος μη νεοπλασματικός νεφρικός ιστός. Και στα δύο αυτά ιστικά διαμερίσματα του συγκεκριμένου υλικού νεφρεκτομής είναι δυνατόν να ταυτοποιηθούν θέσεις δυνητικών stem κυττάρων (σωματικά stem κύτταρα, καρκινικά stem κύτταρα). Η έκφραση των υπό διερεύνηση παραγόντων μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά τόσο στον νεοπλασματικό ιστό (καρκινικά κύτταρα), όσο και στον παρακείμενο του νεοπλάσματος μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό, όπου εκτιμήθηκε η πιθανή κατανομή στα επιθηλιακά κύτταρα των ουροφόρων σωληναρίων, τα σπειράματα και τον διάμεσο χώρο. Εκτιμήθηκε επίσης η ακριβής εντόπιση των υπό μελέτη παραγόντων στα κύτταρα (πυρήνας, κυτταρόπλασμα, κυτταροπλασματική μεμβράνη). Τα αποτελέσματα από τα δείγματα μη νεοπλασματικού νεφρικού παρεγχύματος και καρκινώματος του ίδιου ασθενούς, συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία Wilcoxon. Η παρουσία συσχετίσεων μεταξύ έκφρασης των δεικτών στα ίδια δείγματα ελέχθηκε με τη δοκιμασία συσχετίσεων Spearman Corelation. Για τη σύγκριση πολλαπλών ομάδων, επιστρατεύτηκε η δοκιμασία Kruskal Wallis. Οι κατηγοριοποιημένες μεταβλητές ελέχθησαν με δοκιμασία χ2. Σε όλες τις δοκιμασίες, τιμές με p value < 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με το πρόγραμμα SPSS 16.0 for windows. Όλοι οι υπό εξέταση δείκτες εκφράζονται, σε άλλοτε άλλο βαθμό, τόσο στον νεοπλασματικό ιστό όσο και στον παρακείμενο του όγκου μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό. Στον παρακείμενο του όγκου, μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό, η θετικότητα αφορά κυρίως στα επιθηλιακά κύτταρα των σωληναρίων. Διαπιστώθηκε ασθενής κυτταροπλασματική έκφραση της ΒΜΡ-7 στα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα στον παρακείμενο του όγκου νεφρικό ιστό. Το σημαντικό για την σηματοδότηση της BMP-7, μόριο του υποδοχέα BMPR1B, εκφράζεται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, στο κυτταρόπλασμα αλλά και στον πυρήνα των κυττάρων των ουροφόρων σωληναρίων. Η σαφής παρουσία του υποδοχέα BMPRIB στα κύτταρα των εγγύς σωληναρίων, μπορεί να υποστηρίζει την ενδεχόμενη δράση της ΒΜΡ-7 στα εν λόγω κύτταρα. Αναγνωρίσθηκαν επίσης θέσεις ανοσοϊστοχημικής θετικότητας για τον ανταγωνιστή της BMP-7 γκρεμλίνη στο κυτταρόπλασμα κυττάρων του μη νεοπλασματικού νεφρικού ιστού, σε ινωτικές κυρίως περιοχές. Το γεγονός αυτό, ενδεχομένως επιτείνει την ελάττωση της παρουσίας της BMP-7, αφού η η γκρεμλίνη, ως ανταγωνιστής της ΒΜΡ-7, ανταγωνίζεται την έκφρασή της. Αναγνωρίσθηκε θετική πυρηνική έκφραση των ΕΖΗ2 και OCT4 (για τον δείκτη αυτό και ταυτόχρονη κυτταροπλασματική έκφραση) σε μεμονωμένα κύτταρα των σωληναρίων κυρίως και ελάχιστα των σπειραμάτων.Το SOX2, παρότι ανήκει στους μεταγραφικούς παράγοντες, εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και όχι στον πυρήνα, ενώ εκφραζόταν πυρηνικά σε νευρικό ιστό που χρησιμοποιήθηκε και ως εσωτερικός μάρτυρας. Ουσιαστικά, προκύπτει έντονη κυτταροπλασματική χρώση στα σωληνάρια του παρακείμενου του όγκου νεφρικού ιστού. Το γεγονός αυτό, πιθανόν υποδηλώνει ότι η θετικότητα για το SOX2 δεν αφορά stem κύτταρα στον νεφρό, αλλά μετέπειτα στάδια κυτταρικής διαφοροποίησης, πιθανόν τελικώς διαφοροποιημένα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα. Για την ΑLDH1, παρατηρήθηκε έντονη κυτταροπλασματική εντόπιση στα επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αυξημένη έκφραση της δεν περιορίζεται μόνο στα stem κύτταρα, αλλά παρατηρείται και σε πιο διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα του νεφρού. Σε ότι αφορά το νεόπλασμα, διαπιστώθηκε ασθενής κυτταροπλασματική θετικότητα των καρκινικών κυττάρων για την BMP-7, με σαφή ταυτόχρονη όμως θετικότητα για τους επιμέρους παράγοντες της σηματοδοτικής οδού της BMP-7 που μελετήθηκαν (BMPRIB και γκρεμλίνη) και για τους δυνητικούς δείκτες stem κυττάρων. Αναγνωρίσθηκε θετική ανοσοχρώση για τον μεμβρανικό υποδοχέα BMPRIB στο κυτταρόπλασμα και την κυτταροπλασματική μεμβράνη των νεοπλασματικών κυττάρων, ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει το απροσδόκητο εύρημα και της πυρηνικής εντόπισης του BMPRIB στο νεοπλασματικό ιστό, και ιδιαίτερα στην περιφέρεια σε σχέση με κεντρικότερες περιοχές του όγκου. Η γκρεμλίνη, εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα των νεοπλασματικών κυττάρων. Ο παράγων EZH2, εκφράζεται τον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων, ενώ από πλευράς τοπογραφικής εντόπισης στο νεόπλασμα, διαπιστώθηκε μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης θετικών πυρήνων στην περιφέρεια σε σχέση με κεντρικότερες περιοχές όπου η θετικότητα ήταν ελάχιστη. Αξιοσημείωτη ήταν η διαπίστωση της θετικότητας για EZH2 σε μεγάλο ποσοστό των καρκινικών κυττάρων σε εμφανείς θέσεις διήθησης. Αναδείχθηκε πυρηνική αλλά και κυτταροπλασματική έκφραση του OCT4 στα καρκινικά κυτταρα, με μεγαλύτερη πυρηνική θετικότητα και πυκνότητα στην περιφέρεια σε σχέση με κεντρικότερες περιοχές του όγκου. Η ανοσοιστοχημική έκφραση του SOX2, ήταν εκτενώς κυτταροπλασματική στον νεοπλασματικό ιστό. Η ALDH1 υπερ-εκφράζεται σταθερά και σε μεγάλο ποσοστό στο κυτταρόπλασμα των νεοπλασματικών κυττάρων στον καρκίνο του νεφρού, σε σχέση με όλους τους άλλους παράγοντες που μελετήθηκαν. Παρόλο που χρησιμοποιείται σε μελέτες ως γενικός δείκτης αναγνώρισης και απομόνωσης stem κυττάρων σε διάφορα όργανα, από τα δεδομένα μας, δεν είναι δυνατόν να ισχυριστούμε ότι υποδηλώνει θέσεις φυσιολογικών stem κυττάρων ή καρκινικών stem κυττάρων, στο διαυγοκυτταρικό καρκίνωμα του νεφρού. Τα αποτελέσματα από τα δείγματα μη νεοπλασματικού νεφρικού παρεγχύματος και καρκινώματος του ίδιου ασθενούς συγκρίθηκαν με τη χρήση της στατιστικής δοκιμασίας Wilcoxon. Η πυρηνική έκφραση του BMPRIB, είναι αυξημένη στο νεόπλασμα συγκριτικά με τα σωληνάρια του παρακείμενου στον όγκο νεφρικού παρεγχύματος και η μεταβολή είναι στατιστικά σημαντική (Wilcoxon p<0,001). Επί πλέον, διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ της τιμής έκφρασης της γκρεμλίνης, με εντονότερη έκφραση στον παρακείμενο του όγκου νεφρικό ιστό σε σχέση με τον όγκο (Wilcoxon p<0,001). Σε ότι αφορά την συσχέτιση των μορίων που μελετήθηκαν με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους, η παρούσα μελέτη, δεν απέδειξε την ύπαρξη στατιστικώς σημαντικής διαφοράς στην έκφραση των επί μέρους παραγόντων στον νεοπλασματικό ιστό μεταξύ ανδρών και γυναικών. Η στατιστική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων, όσον αφορά την έκφραση των επί μέρους παραγόντων σε συνάρτηση με την βαθμίδα διαφοροποίησης (Grade) των όγκων, ανέδειξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μόνο για τον παράγοντα ΕΖΗ2 (p<0,007). Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι, όσο αυξάνεται το Grade του νεοπλάσματος τόσο μειώνεται η ανοσοϊστοχημική έκφραση του ΕΖΗ2 στα νεοπλασματικά κύτταρα. Η έκφραση των άλλων δεικτών είτε στον πυρήνα είτε στο κυτταρόπλασμα, δεν μεταβάλλεται στατιστικώς σημαντικά μεταξύ των Grade του όγκου. Η στατιστική ανάλυση κατά Spearman ανέδειξε θετικές συσχετίσεις μεταξύ αρκετών δεικτών της παρούσας μελέτης. Στα κύτταρα του όγκου διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ OCT4 και BMPRIΒ (ένταση πυρηνικής έκφρασης p<0,015, r=0,48, ένταση κυτταροπλασματικής έκφρασης p<0,016, r=0,361). Θετική συσχέτιση διαπιστώθηκε επίσης στα κύτταρα του όγκου μεταξύ OCT4 και ΕΖΗ2 (έκταση πυρηνικής έκφρασης στην περιφέρεια του όγκου p<0,037, r=0,382). Επί πλέον, αναγνωρίσθηκε θετική συσχέτιση στα κύτταρα του όγκου μεταξύ SOX2 και γκρεμλίνης (ένταση κυτταροπλασματικής έκφρασης p<0,002, r=0,467, έκταση κυτταροπλασματικής έκφρασης p<0,019, r=0,334), αλλά και μεταξύ SOX2 και BMPRIΒ (ένταση κυτταροπλασματικής έκφρασης p<0,05, r=0,293). Όσον αφορά τα επιθηλιακά κύτταρα των ουροφόρων σωληναρίων στον παρακείμενο του όγκου μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό, διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ SOX2 και BMPRIΒ (κυτταροπλασματική έκφραση p<0,035, r = 0,338). Σε ό,τι αφορά τα σπειράματα στον παρακείμενο του νεοπλάσματος μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό δεν προέκυψε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των παραγόντων που μελετήθηκαν. Οι ανωτέρω στατιστικές συσχετίσεις εκτελέστηκαν, με σκοπό την διερεύνηση ενδεχόμενης “συνομιλίας” μεταξύ των επιλεγμένων μορίων της εργασίας. Τα συμπεράσματα που προκύπτουν, θα πρέπει να αξιολογηθούν με την επιφύλαξη ότι, η ανοσοϊστοχημική μέθοδος προσφέρει μόνο την πληροφορία της συνύπαρξης των παραγόντων στα καρκινικά και στα παρακείμενα του νεοπλάσματος, νεφρικά κύτταρα, και δεν διερευνά ουσιαστικά την λειτουργική τους αλληλεπίδραση. Από την μελέτη μας προκύπτει το συμπέρασμα πιθανής “διασυνομιλίας” του μορίου της σηματοδοτικής οδού BMPRΙΒ με τους δείκτες stem κυττάρων OCT4 και SOX2. Οι συσχετίσεις αυτές, σε συνδυασμό με την ενδιαφέρουσα συν-έκφραση των BMPRIB, OCT4 και EZH2, στην περιφέρεια κυρίως του νεοπλάσματος, καθιστά, ίσως, τους δείκτες αυτούς, λειτουργικούς παράγοντες σε κοινά δίκτυα μεταγωγής σήματος. Ωστόσο, η ανοσοϊστοχημική συσχέτιση του BMPRIB με τους προαναφερθέντες δείκτες stem κυττάρων, εμπεριέχει τον κίνδυνο υπεραπλούστευσης κατά την εξαγωγή συμπερασμάτων λειτουργικής συσχέτισης, εξαιτίας του πυκνού δικτύου σηματοδότησης όπου συμμετέχουν οι παράγοντες αυτοί. Τα αποτελέσματα από τις στατιστικές δοκιμασίες που προέκυψαν, παρά τον κίνδυνο υπερεκτίμησης των συσχετίσεων των υπό διερεύνηση μοριακών δεικτών, που εμπεριέχουν, εισηγούνται πιθανώς την αλληλεπίδραση και διαπλοκή των μοριακών αυτών δικτύων στις φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες του νεφρού. Στον παρακείμενο του όγκου μη νεοπλασματικό νεφρικό ιστό, όπως αναφέρθηκε, διαπιστώθηκε ανοσοϊστοχημική πυρηνική θετικότητα σε μεμονωμένα κύτταρα κυρίως των ουροφόρων σωληναρίων για τους δείκτες Oct4 EZH2 και ΒΜΡRIB. Τα συγκεκριμένα ευρήματα πιθανόν εισηγούνται το ενδεχόμενο της παρουσίας δυνητικών stem κυττάρων στις θέσεις αυτές. Όσον αφορά τον νεοπλασματικό ιστό, διαπιστώθηκε ανοσοϊστοχημική πυρηνική θετικότητα στα καρκινικά κύτταρα για τους δείκτες OCT4 EZH2 και ΒΜΡRIB, με ιδιαίτερη κατανομή στην περιφέρεια του νεοπλάσματος σε σχέση με κεντρικότερες περιοχές. Αξιοσημείωτη ήταν η διαπίστωση της θετικότητας για EZH2 σε μεγάλο ποσοστό των καρκινικών κυττάρων σε εμφανείς θέσεις διήθησης. Το απροσδόκητο εύρημα της εντόπισης στον πυρήνα, του μεμβρανικού υποδοχέα ΒΜΡRIB, συμβαδίζει με ανάλογη διαπίστωση για γνωστή κυτταροπλασματική πρωτεϊνη (β-κατενίνη) σε κύτταρα με εντόπιση στην διηθητική παρυφή του καρκίνου στο παχύ έντερο. Τα κύτταρα αυτά έχουν χαρακτηρισθεί ως καρκινικά stem κύτταρα τα οποία υφίστανται την διαδικασία της ΕΜΤ. Στην ΕΜΤ, έχει αποδοθεί επίσης η δυνατότητα να προσδίδει σε κύτταρα ιδιότητες stem κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη η εφαρμογή της στατιστικής δοκιμασίας συσχετίσεων Spearman, ισχυροποίησε τα μορφολογικά ευρήματα για τους OCT4 EZH2 και ΒΜΡRIB, αναδεικνύοντας θετική, στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ Oct4 και ΒΜΡRIB (p<0,015) καθώς και OCT4 και EZH2 (p<0,037). Όλα τα προαναφερθέντα υποστηρίζουν το ενδεχόμενο της παρουσίας δυνητικών καρκινικών stem κυττάρων στο Διαυγοκυτταρικό καρκίνωμα του Νεφρού.