| Περίληψη: | Η ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος ξεκινά από πολυδύναμα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, τα οποία διαδοχικά δίνουν γένεση σε ενδιάμεσους πληθυσμούς προγονικών κυττάρων οι οποίοι σταδιακά χάνουν την ικανότητά τους για αυτοανανέωση και τελικά δίνουν γένεση στα πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα της μυελικής και λεμφικής σειράς. Η συγκεκριμένη διαδικασία στηρίζεται στο λεπτό συντονισμό της αυτοανανέωσης, αλλά και της διαφοροποίησης, απαιτεί δε την έκφραση διαφορετικών γονιδίων που σχετίζονται με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, τη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων, αλλά και συμπλόκων αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση.
Η geminin έχει προταθεί ότι ρυθμίζει την απόφαση ενός κυττάρου για πολλαπλασιασμό ή διαφοροποίηση. Αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες, με σύμπλοκα αναδιάταξης της δομής της χρωματίνης, ρυθμίζοντας την έκφραση γονιδίων που ελέγχουν τη νευρωνική διαφοροποίηση. Παράλληλα, δρα σαν αναστολέας του κυτταρικού κύκλου, προσδενόμενη στο παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, CDT1. Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε τον in vivo ρόλο της Geminin στη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό, στο ανοσοποιητικό σύστημα.
Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής, βασιζόμενοι στο σύστημα Cre-loxP, δημιουργήσαμε μύες που επιτρέπουν την υπό συνθήκη εξάλειψη (knockout) του γονιδίου της geminin, πλαισιώνοντας τα εξώνια 3 και 4 του γονιδίου της με θέσεις loxP. Η στόχευση του γονιδίου και η παρεμβολή των 3 loxP θέσεων πραγματοποιήθηκε σε pc3 εμβρυικά πολυδύναμα κύτταρα μυός, χρησιμοποιώντας κατάλληλο πλασμιδιακό knockout φορέα, που έφερε τη κασέτα επιλογής TKneo. Μετά από ένεση των ορθά ανασυνδυασμένων pc3 κλώνων σε βλαστοκύστεις, τη δημιουργία χιμαιρικών μυών που εκφράζουν την Cre ρεκομπινάση στη γαμετική σειρά, και την επακόλουθη διασταύρωσή τους με μύες αγρίου τύπου, δημιουργήθηκαν ετερόζυγοι μύες για το πλαισιωμένο με loxP θέσεις αλληλόμορφο της Geminin, που παράλληλα έφερε και τη κασέτα επιλογής TKneo («floxed-ΤΚneo»), το πλαισιωμένο με loxP θέσεις αλληλόμορφο της Geminin, που στερούνταν της κασέτας επιλογής TKneo (floxed), καθώς επίσης και το αλληλόμορφο που στερούνταν των εξωνίων 3 και 4 και είναι το πλήρες knockout (ΔGEM ΚΟ -null) αλληλόμορφο). Από διασταυρώσεις ετερόζυγων για το ΔGEM ΚΟ αλληλόμορφο της geminin, δεν προέκυψαν ομόζυγοι μύες για το ΔGEM ΚO αλληλόμορφο (-/-), τόσο μεταγεννητικά όσο και in utero. Η μειωμένη αντιπροσώπευση των ΔGEM+/- μυών σε συνδυασμό με την αύξηση των Thy1-/B220- κυττάρων σε σπλήνα και λεμφαδένες ενήλικων μυών, η σημαντική αύξηση των Thy1+ και ειδικότερα των CD8+ Τ κυττάρων, καθώς επίσης και η αισθητή μείωση των CD4+ Τ κυττάρων του σπλήνα σε ζώα ηλικίας 5 μηνών, προτείνει ένα είδος απλοανεπάρκειας των ετερόζυγων για Geminin μυών. Σε παραπλήσια αποτελέσματα οδηγηθήκαμε και μετά από την ανάλυση των GT KO για το γονίδιο της Geminin (GT) μυών με τη μεθοδολογία της παγίδευσης γονιδίων.
Τα ετερόζυγα GT ζώα διασταυρώθηκαν με ετερόζυγα ζώα για το πλήρες ΚΟ του BRG1 (BRG) και με ετερόζυγα ζώα που υπερεκφράζουν μια επικρατούσα κατασταλτική μορφή του BAF57 (BAFΔΝ, BAF), προκειμένου να διαπιστωθεί εάν υπάρχει γενετική αλληλεπίδραση μεταξύ της Geminin και των μελών του συμπλέγματος αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης SWI/SNF, BRG1 και BAF57 που έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την ανάπτυξη και διαφοροποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος.
Ιστοειδικά, χρησιμοποιώντας την floxedΤΚneo σειρά μυών σε συνδυασμό με την CD2-Cre, που επιτρέπει την εξάλειψη του γονιδίου από το στάδιο των DN κυττάρων του θύμου και μετά, είδαμε ότι η ανάπτυξη του θύμου δεν φαίνεται να επηρεάζεται κατά την απουσία της Geminin, ενώ αντίθετα ο ολικός αριθμός των σπληνοκυττάρων μειώνεται στα FlTKneo/KO;CD2 σε σχέση με τα WT. Μιτωγονική διέγερση με ConA εναιωρήματος σπληνοκυττάρων από FlTKneo/KO;CD2 και WT ζώα, έδειξε ότι τα FlTKneo/KO;CD2 Τ λεμφοκύτταρα αδυνατούν να διαιρεθούν.
Τέλος, έγινε προσπάθεια για ιστοειδική υπερέκφραση στο ανοσοποιητικό σύστημα της ανθρώπινης Geminin συντηγμένης με τη πράσινη φθορίζουσα χρωστική (GFP). Το συγκεκριμένο σύστημα επιτρέπει την υψηλή έκφραση του διαγονιδίου κυρίως στα Τ κύτταρα. Ενώ προέκυψαν ιδρυτές για όλες τις πιο πάνω σειρές τόσο με χαμηλή όσο και με υψηλή ενσωμάτωση του διαγονιδίου, η έκφραση της GFP δεν κατέστη δυνατόν να ανιχνευθεί με FACS.
Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι η Geminin είναι ιδιαίτερα σημαντική κατά τα αρχικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου μυός, ενώ ιστοειδικά στο ανοσοποιητικό σύστημα η πλήρης εξάλειψή της δεν έχει καμία επίπτωση στην ανάπτυξη του θύμου αδένα, ενώ αντίθετα στη σπλήνα εμφανίζονται μειωμένοι οι πληθυσμοί των ώριμων CD4 και CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Τέλος, φαίνεται να συνεργάζεται με το σύμπλεγμα αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης SWI/SNF στη ρύθμιση των CD4 κυττάρων του θύμου αδένα και των CD8 του σπλήνα.
|
|---|
