| Περίληψη: | Η χρονική και χωρική ρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής του DNA
συντονίζεται από τη διαδικασία της «αδειοδότησης της αντιγραφής», η οποία
εξασφαλίζει ότι η αντιγραφή θα λάβει χώρα μόνο μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο. Η
αδειοδότηση της αντιγραφής περιλαμβάνει την κατά βήμα συγκρότηση ενός
συμπλόκου πρωτεϊνών, του προαντιγραφικού συμπλόκου, στις περιοχές έναρξης της
αντιγραφής. Μείζον συστατικό του συμπλόκου αυτού είναι η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία
επίσης αποτελεί πρωτεολυτικό στόχο των σημείων ελέγχου κυττάρων που φέρουν
βλάβες στο DNA. Στα μετάζωα, υπάρχει μια μικρή πρωτεΐνη καλούμενη Geminin, η
οποία προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1, αναστέλλοντας την αδειοδότηση της
αντιγραφής. Η πρωτεΐνη Geminin αλληλεπιδρά με ομοιοτικούς μεταγραφικούς
παράγοντες και πρωτεΐνες που αναδιαμορφώνουν τη χρωματίνη και πιστεύεται ότι
αποτελεί πιθανό κρίκο που συνδέει τις διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της
διαφοροποίησης.
Στην παρούσα μελέτη δείξαμε πως η πρωτεΐνη Geminin κατατμείται σε
πρωτογενή κύτταρα και καρκινικές κυτταρικές σειρές που οδηγούνται προς
απόπτωση. Η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin διαμεσολαβείται από την κασπάση-
3 τόσο in vivo όσο και in vitro. Δύο περιοχές στο καρβοξυτελικό τμήμα της Geminin
(Κ1 και Κ2), στοχεύονται κατά την απόπτωση προκαλώντας τη δημιουργία
θρυσμάτων της πρωτεΐνης Geminin. Δείξαμε ότι η κατάτμηση της πρωτεΐνης
Geminin στη θέση Κ1 προάγει τον αποπτωτικό φαινότυπο και ρυθμίζεται μέσω
φωσφορυλίωσης από την κινάση Casein Kinase II. Αντίθετα, μετά από κατάτμηση
στη θέση Κ2, η πρωτεΐνη Geminin χάνει την ικανότητα αλληλεπίδρασης με την
πρωτεΐνη Brm, καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου αναδιαμόρφωσης της
χρωματίνης SWI/SNF, ενώ διατηρεί την ικανότητα να προσδένεται στην πρωτεΐνη
Cdt1, υποδεικνύοντας πως η στόχευση της πρωτεΐνης Geminin κατά την απόπτωση,
επηρεάζει διαφορικά τη λειτουργία του μορίου.
Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διερευνήσαμε τη ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1
στο χώρο και στο χρόνο σε κύτταρα με βλάβες στο DNA. Για το σκοπό αυτό,
χαρακτηρίσαμε μια μέθοδο που προκαλεί εντοπισμένες βλάβες στο DNA των
κυττάρων, βασιζόμενη στη χρήση ενός παλμικού UVA laser. Με τη χρήση της
μεθόδου αυτής, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης
τόσο σε καρκινικά όσο και πρωτογενή κύτταρα, παράλληλα με πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική απόκριση στη βλάβη (γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70,
pATM κ.ά.). Η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 λαμβάνει χώρα ταχύτατα και
προηγείται της αποικοδόμησής της. Με τη δημιουργία μεταλλαγμένων μορφών της
πρωτεΐνης Cdt1 και την καταστολή της έκφρασης πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με
την πρωτεΐνη Cdt1 με τη χρήση siRNA, δείξαμε πως η στρατολόγηση της πρωτεΐνης
Cdt1 στην περιοχή της βλάβης απαιτεί αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη PCNA.
Βρέθηκε πως η πρωτεΐνη Cdt2, που αποτελεί μέλος του συμπλόκου της λιγάσης της
ουβικουϊτίνης Cul4-DDB1Cdt2 επίσης στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης.
Ποσοτικοποίηση της κινητικής συσσώρευσης πρωτεϊνών στην περιοχή της βλάβης
έδειξε ότι η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 υφίσταται κορεσμό νωρίτερα από τις
πρωτεΐνες PCNA και Cdt2, ενώ αποσιώπηση της πρωτεΐνης Cdt1 δεν επηρεάζει τη
στρατολόγηση των πρωτεϊνών PCNA και Cdt2. Πειράματα προσδιορισμού κινητικών
αλληλεπιδράσεων με τη μέθοδο FRAP, έδειξαν ότι η πρωτεΐνη PCNA παραμένει
σταθερά προσδεδεμένη στην περιοχή της βλάβης, ενώ η πρωτεΐνη Cdt1 εμφανίζει
ιδιαίτερα γρήγορη κινητική. Οι μελέτες αυτές οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η
πρόκληση εντοπισμένης βλάβης στο DNA οδηγεί σε εντοπισμένη κυτταρική
απόκριση και στη στρατολόγηση της πρωτεΐνης PCNA στην περιοχή της βλάβης η
οποία δρά ως ικρίωμα για τη δυναμική αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Cdt1.
Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της διδακτορική διατριβής περιγράφεται για
πρώτη φορά ότι η πρωτεϊνη Geminin στοχεύεται για κατάτμηση κατά την απόπτωση,
διαλευκάνονται τα μοριακά μονοπάτια που ρυθμίζουν το φαινόμενο αυτό και
διερευνάται η φυσιολογική του σημασία. Προτείνεται ότι η στόχευση της Geminin
από την κασπάση 3 επηρεάζει τη φυσιολογική ισορροπία μεταξύ κυτταρικού
πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης. Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής
διατριβής δείχνεται ότι η πρωτεϊνη Cdt1 στρατολογείται σε περιοχές της χρωματίνης
που φέρους βλάβες στο DNA. Η στρατολόγηση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της
βλάβης, παράλληλα με πρωτεϊνες απόκρισης στη βλάβη όπως οι BRCA1, pATM και
Ku70, οδηγεί σε μία νέα υπόθεση για πιθανή εμπλοκή της πρωτεϊνης Cdt1 στην
κυτταρική απόκριση σε βλάβες στο DNA.
|
|---|
