Κλωνοποίηση του γονιδίου της geminin του ποντικού και δημιουργία πλασμιδιακού

• Κύριος συγγραφέας: Κοταντάκη, Πανωραία
• Άλλοι συγγραφείς: Ταραβήρας, Σταύρος
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2007
• Θέματα: Πλασμιδιακά οχήματα μεταφοράς; Εμβρυονικά πολυδύναμα κύτταρα ποντικού; Geminin; Cre-loxP system; Targeting vector; Mouse embryonic stem cells; 660.65

Η geminin είναι ένα σχετικά καινούριο μόριο το οποίο διαθέτει καίριο ρόλο κατά την ανάπτυξη και την διαφοροποίηση, εξαιτίας του νευροποιητικού δυναμικού της, της ικανότητάς της να αλληλεπιδρά με μέλη των Hox και polycomb πρωτεϊνών, καθώς επίσης και να δρα σαν ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου, λειτουργώντας ως αναστολέας του παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, CDT1. Στα πλαίσια της εργασίας αυτής, κλωνοποιήσαμε το γονίδιο της geminin στο ποντίκι το οποίο αποτελείται από 7 εξώνια και καλύπτει μία περιοχή γύρω στα 10Kb. Σχεδιάσαμε και κλωνοποιήσαμε ένα πλασμιδιακό όχημα στόχευσης για το γονίδιο της mgeminin και εισήγαμε 3 θέσεις loxP στο γενωμικό locus αυτής, με σκοπό να δημιουργήσουμε υπό συνθήκη ελλειμματικούς ποντικούς για το γονίδιό της. Χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο φορέα στόχευσης αδρανοποιήσαμε το γονίδιο της Geminin σε pc3 (protamine Cre 3) πολυδύναμα κύτταρα ποντικού, δημιουργώντας ετερόζυγους ES κλώνους που φέρουν το «floxed» αλληλόμορφο, καθώς επίσης και το αλληλόμορφο αγρίου τύπου. Το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ελέγχθηκε τόσο με PCR όσο και με ανάλυση κατά Southern για την ορθότητα του ομόλογου ανασυνδυασμού. Ταυτοποιήσαμε 15 ορθά ανασυνδυασμένους ES κλώνους, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία υπό συνθήκη knockout ποντικών για το γονίδιο της geminin, μετά από έγχυση σε B6 βλαστοκύστεις και επακόλουθη μεταφορά αυτών σε θετές μητέρες.