| Περίληψη: | Η φυσιολογική ανάπτυξη του εμβρύου των θηλαστικών επιτυγχάνεται μέσα από τη συντονισμένη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων που προκύπτουν από τις διαιρέσεις του ζυγωτού. Έτσι λαμβάνει χώρα ο σταδιακός καθορισμός της τύχης των πολυδύναμων αυτών κυττάρων, τα οποία προσανατολίζονται κατάλληλα κατά μήκος του πρόσθιο-οπίσθιου και του ραχιαίο-κοιλιακού άξονα του εμβρύου. Ο κατάλληλος προσανατολισμός εξασφαλίζει την έκθεση των κυττάρων σε τοποειδικά εκφραζόμενους μεταγραφικούς παράγοντες που ελέγχουν τη μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων. Μέσα λοιπόν από σύνθετα γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα συμβαίνει η διαφοροποίηση των πρόδρομων κυττάρων προς ειδικούς τύπους κυττάρων με συγκεκριμένη μορφή και λειτουργία. Συχνά, μάλιστα, σχεδιάζονται πειραματικά πρωτόκολλα που μιμούνται τις διαδικασίες της διαφοροποίησης συγκεκριμένων κυτταρικών τύπων ξεκινώντας από βλαστοκύτταρα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον μεταξύ αυτών εμφανίζει η διαφοροποίηση κύτταρων που παράγουν ινσουλίνη, τα οποία θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για τη θεραπεία ευρέως διαδεδομένων ασθενειών όπως ο ινσουλινοεξαρτώμενος διαβήτης. Η αποκάλυψη, επομένως, των ρυθμιστικών δικτύων που κατευθύνουν τη διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων υπόσχεται να βελτιώσει τα σχετικά πρωτόκολλα διαφοροποίησης αλλά και να συμβάλλει ενδεχομένως στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της ασθένειας. Με τον όρο ρυθμιστικό δίκτυο υποδηλώνεται ένα σύνολο αλληλεπιδράσεων μεταξύ μεταγραφικών παραγόντων (trans-trans) αλλά και μεταξύ γονιδιακών περιοχών και πρωτεϊνών που ελέγχουν τη μεταγραφή (cis-trans). Στην παρούσα διατριβή, αντικείμενο εξέτασης αποτέλεσαν οι ρυθμιστικές αλληλουχίες ενός συνόλου γονιδίων τα οποία, με βάση πειραματικά δεδομένα διερεύνησης της γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχίες DNA, φαίνονταν να σχετίζονται με τη διαφοροποίηση των β-κυττάρων του παγκρέατος των θηλαστικών. Oι ρυθμιστικές αλληλουχίες συνήθως προσδένουν μεταγραφικούς παράγοντες και λόγω του σημαντικού τους ρόλου δέχονται έντονη εξελικτική πίεση. Δεδομένης λοιπόν της εξελικτικής συντήρησης των ρυθμιστικών στοιχείων, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της συγκριτικής γονιδιωματικής με στόχο την ανεύρεση συντηρημένων ρυθμιστικών αλληλουχιών. Με σύγκριση ορθόλογων γονιδιωματικών περιοχών σε ένα σύνολο οργανισμών που περιλάμβανε ακόμη και τους πιο απομακρυσμένους φυλογενετικά οργανισμούς που διαθέτουν πάγκρεας, ταυτοποιήθηκαν συντηρημένες θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων. Πιο αναλυτικά, τα γονίδια που μελετήθηκαν επιλέχθηκαν με κριτήριο τη γνωστή ή πιθανή ρύθμισή τους από το μεταγραφικό παράγοντα NGN3, τον κύριο καθοδηγητή της διαφοροποίησης των ενδοκρινών κυττάρων του παγκρέατος. Με βάση πειραματικά δεδομένα ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης και με τη βοήθεια ισχυρών και ευέλικτων αλγορίθμων αναζητήθηκαν κοινά cis ρυθμιστικά στοιχεία στα ορθόλογα επαγόμενων και καταστελλόμενων από τον NGN3 γονιδίων. Παράλληλα αναζητήθηκαν διαφορές ανάμεσα στις ρυθμιστικές περιοχές των αντίστοιχων ομάδων γονιδίων. Αποκαλύφθηκε, έτσι, η ύπαρξη μιας συντηρημένης ρυθμιστικής περιοχής σε όλα τα ορθόλογα των οργανισμών που διαθέτουν πάγκρεας, η οποία περιλάμβανε θέσεις πρόσδεσης για μεταγραφικούς παράγοντες που εμπλέκονται στις διαδικασίες διαφοροποίησης των κυττάρων της ενδοκρινούς μοίρας του παγκρέατος. Η συγκεκριμένη περιοχή δεν εντοπίστηκε σε γονίδια των οποίων η έκφραση δεν σχετίζεται με την προηγούμενη διαδικασία, είτε αυτά εκφράζονται συνεχώς (B-ACTIN), είτε δεν εκφράζονται καθόλου στο πρώιμο έμβρυο (B-GLOBIN). Επιπλέον, η διερεύνηση εντοπισμού νουκλεοτιδικών προτύπων στις αλληλουχίες των ρυθμιστικών στοιχείων αποκάλυψε, επιπροσθέτως την παρουσία αλληλουχιών πρόσδεσης για τον παράγοντα AP4 μέσα στα ρυθμιστικά στοιχεία των καταστελλόμενων από τον NGN3 γονιδιών. Έγινε, έτσι, διάκριση των προαναφερθέντων ρυθμιστικών στοιχείων σε αυτά που φέρουν θέση πρόσδεσης για τον AP4 και σε αυτά που δεν φέρουν. Παράλληλα η ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώματος του ποντικού και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων κατέδειξαν πως και τα δύο στοιχεία δεν εντοπίστηκαν τυχαία στα γονίδια που ελέγχονταν μεταγραφικά από τον NGN3. Δεδομένου ότι στην πλειοψηφία των γονιδίων που εξετάστηκαν οι ρυθμιστικές αυτές περιοχές εντοπίστηκαν μακριά από το σημείο έναρξης της μεταγραφής εκτιμήθηκε πως πρόκειται για ακολουθίες με ρόλο ενισχυτή, οι οποίες σε περίπτωση που μπορούν να προσδέσουν επιπροσθέτως και τον παράγοντα AP4 μετατρέπονται σε επιλεκτικούς καταστολείς των αντιστοίχων γονιδίων. Το τελευταίο συμπέρασμα υποστηρίχτηκε και από την ανάλυση της περιεκτικότητας των ρυθμιστικών στοιχείων σε GC που έδειξε ότι, όπως και οι περισσότερες αλληλουχίες με ρυθμιστικό ρόλο κατά την εμβρυογένεση, έτσι και οι συγκεκριμένες ήταν πτωχές σε GC, κάτι όμως που γενικότερα δεν ισχύει για τους υποκινητές. Η διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών-μεταγραφικών παραγόντων (trans-trans) που κατά πρόβλεψη προσδένονται στα συντηρημένα ρυθμιστικά στοιχεία αποκάλυψε την ύπαρξη ενός συμπλόκου από γενικούς και ειδικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Το σύμπλοκο αυτό συνδεόμενο με ειδικούς μεταγραφικούς ρυθμιστές μπορεί να λειτουργεί άλλοτε ως επαγωγέας και άλλοτε ως καταστολέας της μεταγραφής συγκεκριμένων γονιδίων. Σημαντικό ρόλο στη διαφορική λειτουργία του συγκεκριμένου συμπλόκου θεωρήθηκε ότι διαδραματίζει η αλλαγή των επιπέδων ακετυλίωσης της χρωματίνης λόγω της παρουσίας ακετυλασών και αποακετυλασών στο σύμπλοκο. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών (trans-trans), μαζί με τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των γονιδίων που αναλύθηκαν (cis-cis) αλλά και οι συνδυασμοί αυτών ενσωματώθηκαν σε ένα ευρύτερο ρυθμιστικό δίκτυο με κεντρικό ρυθμιστή τον NGN3. Προέκυψε, λοιπόν, ένα ρυθμιστικό δίκτυο, από το οποίο υποδεικνύεται ότι με επιλεκτική επαγωγή συγκεκριμένων γονιδίων και με καταστολή άλλων επιτυγχάνεται τελικά η διαφοροποίηση κυττάρων ικανών να παράγουν ινσουλίνη.
|
|---|
