| Περίληψη: | Το ριβοσωματικό RNA (rRNA) παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της ακριβούς αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας. Σύμφωνα με πρόσφατες κρυσταλλικές δομές υψηλής ευκρίνειας της μικρής υπομονάδας του προκαρυωτικού ριβοσώματος, η περιοχή αποκωδικοποίησης αποτελείται κυρίως από rRNA, περιλαμβάνοντας κυρίως τις έλικες 18 και 34, καθώς και τις αδενίνες Α1492 και Α1493 της έλικας 44 του 16S rRNA. Επιπροσθέτως, ο ρόλος του rRNA στην ακριβή αποκωδικοποίηση της γενετικής πληροφορίας έχει αποκαλυφθεί εκτενώς μέσω κατασταλτικών ή αντικατασταλτικών μεταλλάξεων, οι οποίες αυξάνουν ή μειώνουν τη λανθασμένη ανάγνωση του mRNA, αντίστοιχα. Πολλές από τις μεταλλάξεις αυτές αφορούν στο 16S rRNA της Escherichia coli. Μεταξύ αυτών είναι η μετάλλαξη C310G στην έλικα 12, η G1206C στην έλικα 34 και η G517A στην έλικα 18.
Στο πρώτο μέρος της παρούσης μελέτης εξετάσθηκε το αντίκτυπο των αντίστοιχων μεταλλάξεων com1 (C310G), com6 (G1206C) και rdn2 (G517A) στο 18S rRNA του Saccharomyces cerevisiae. Τα κύτταρα yeast μετασχηματίστηκαν με rDNA πλασμίδια αγρίου-τύπου (wt) ή μεταλλαγμένα, τα οποία έφεραν τις προαναφερθείσες μεταλλάξεις. Τα κύτταρα που ελέγχθηκαν ήταν το αγρίου τύπου (rdnwt), τα μεταλλάγματα rdn2, com1, καθώς και τα διπλά μεταλλάγματα com1rdn2 και com6rdn2. Το αντίκτυπο της μετάλλαξης com6 εξήγχθη έμμεσα από το διπλό μετάλλαγμα com6rdn2, αφού το μετάλλαγμα com6 δεν ήταν διαθέσιμο στο Εργαστήριο (Τα στελέχη αυτά χορηγήθηκαν από το Εργαστήριο της Dr Susan Liebman, University of Illinois at Chicago, USA).
Όσον αφορά στη μελέτη ανάπτυξης των στελεχών αυτών, τα στελέχη com1 παρουσίασαν εξαιρετικά αργή ανάπτυξη παρουσιάζοντας 3 φορές αύξηση του χρόνου διπλασιασμού τους σε σχέση με τα κύτταρα rdnwt. Αντίθετα, το μετάλλαγμα rdn2 παρουσίασε παρόμοιο φαινότυπο ανάπτυξης με τα rdnwt. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα διπλά μεταλλάγματα com1rdn2 και com6rdn2 παρουσίασαν μικρότερο χρόνο διπλασιασμού από τα κύτταρα rdnwt.
Όσον αφορά στη μεταφραστική ακρίβεια, το μετάλλαγμα com1 παρουσίασε 1,5 φορά αύξηση στο ρυθμό λανθασμένης ενσωμάτωσης του αμινοξέος λευκίνη σε μία αυξανόμενη αλυσίδα πολυφαινυλαλανίνης κατά την in vitro μετάφραση ενός poly(U) εκμαγείου, σε σχέση με τα κύτταρα rdnwt. Αντίθετα, η μετάλλαξη rdn2 οδήγησε σε μεταφραστική υπερακρίβεια, αφού δεν βρέθηκε καμία ενσωμάτωση λανθασμένου αμινοξέος ανά 10.000 κωδικόνια mRNA. Το διπλό μετάλλαγμα com1rdn2 εμφάνισε παρόμοια επίπεδα μεταφραστικής ακρίβειας με κύτταρα rdnwt. Έτσι, οι μεταλλάξεις com1 και rdn2 επηρρεάζουν τη μεταφραστική ακρίβεια σε ίσο βαθμό, αλλά προς αντίθετες κατευθύνσεις. Το άλλο διπλό μετάλλαγμα της παρούσης μελέτης com6rdn2 παρουσίασε επίσης παρόμοια επίπεδα μεταφραστικής ακρίβειας με το rdnwt, αποκαλύπτοντας έτσι πως η μετάλλαξη com6 οδηγεί επίσης σε μείωση της μεταφραστικής πιστότητας. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι το αντίκτυπο των μεταλλάξεων com1, com6 και rdn2 στην ακρίβεια της μετάφρασης είναι ανεξάρτητο και προσθετικό και όχι συνεργιστικό. Επιπρόσθετη επιβεβαίωση προήλθε με την in vitro μετάφραση εκμαγείων poly(U) παρουσία παρομομυκίνης (PM), ενός αμινογλυκοζιτικού αντιβιοτικού γνωστού για την αύξηση της ενσωμάτωσης λανθασμένων αμινοξέων στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα τόσο στα προκαρυωτικά, όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το στέλεχος com1 παρουσίασε 3 φορές αύξηση στη συχνότητα λάθους κατά τη μετάφραση σε σχέση με το rdnwt, επιβεβαιώνοντας το χαρακτηρισμό του ώς επιρρεπές σε λάθη μετάλλαγμα. Αντίθετα, το στέλεχος rdn2 εμφάνισε μισή περίπου συχνότητα λαθών κατά τη μετάφραση σε σχέση με τα κύτταρα rdnwt, σε συμφωνία με το προηγούμενο χαρακτηρισμό του ως υπερακριβές μετάλλαγμα.
Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με in vivo μελέτες ανθεκτικότητας έναντι της PM τόσο σε υγρές όσο και σε στερεές καλλιέργειες (τρυβλία petri). Το μετάλλαγμα com1 βρέθηκε το πιο ευαίσθητο όλων, αφού το 50% αναστολής της ανάπτυξής του παρατηρήθηκε σε μόλις 5 μΜ PM σε σχέση με τα 75 μΜ για το στέλεχος rdnwt. Αντίθετα, η τιμή IC50 της PM για το rdn2μετάλλαγμα βρέθηκε ίσο προς 500 μΜ. Το διπλό μετάλλαγμα com1rdn2 παρουσίασε παρόμοια επίπεδα ευαισθησίας στην PM με rdnwt, ενώ το άλλο διπλό μετάλλαγμα com6rdn2 αποδείχθηκε ως πιο ανθεκτικό (IC50 = 125 μΜ), υποδηλώνοντας ότι η com6 πρέπει να είναι λιγότερο επιρρεπής σε λάθη σε σχέση με την com1 μετάλλαξη. Πειράματα in vivo ανθεκτικότητας στην PM (σε τρυβλία petri) επιβεβαίωσαν τα επίπεδα ευαισθησίας που αποκαλύφθηκαν με τις υγρές καλλιέργειες.
Η μελέτη των μεταλλάξεων αυτών ολοκληρώθηκε με πειράματα πρόσδεσης στις θέσεις A και P του ριβοσώματος. Οι μεταλλάξεις που μειώνουν την μεταφραστική πιστότητα οδηγούν και σε αύξηση της ικανότητας πρόσδεσης μορίων αμινο-ακυλο tRNA (aa-tRNA) στη θέση Α του ριβοσώματος, ενώ αντίθετα οι μεταλλάξεις που αυξάνουν την ακρίβεια της μετάφρασης συνοδεύονται και από μείωση της ικανότητας πρόσδεσης aa-tRNAs στη θέση Α του ριβοσώματος. Με τέτοιες μελέτες βρέθηκε ότι η μετάλλαξη com1 οδήγησε σε αύξηση της ικανότητας πρόσδεσης στη θέση Α, αντίθετα με την rdn2, όπου διαπιστώθηκε ακόμη μικρότερη ικανότητα πρόσδεσης και σε σχέση με τα ριβοσώματα αγρίου τύπου. Τα διπλά μεταλλάγματα έδειξαν λίγο μεγαλύτερη ικανότητα πρόσδεσης σε σχέση με αυτά του αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαίωσαν το χαρακτηρισμό των com1 και com6 ως μεταλλάξεις μείωσης της μεταφραστικής ακρίβειας σε αντίθεση με τη μετάλλαξη rdn2, η οποία οδηγεί σε υπερακρίβεια. Όσον αφορά στην ικανότητα πρόσδεσης aa-tRNAs στη θέση P του ριβοσώματος σε σχέση με τα ριβοσώματα αγρίου τύπου (rdnwt), αυτή βρέθηκε μεγαλύτερη στην περίπτωση της com1 μετάλλαξης και μικρότερη στην περίπτωση της rdn2 μετάλλαξης, υποδηλώνοντας ότι η com1 οδηγεί σε μεγαλύτερο ρυθμό πρωτεϊνοσύνθεσης σε σχέση με την υπερακριβή rdn2 μετάλλαξη.
Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διερευνήσαμε σε συνεργασία με το Εργαστήριο Βιοχημείας του κ. Χρήστου Γεωργίου (Τμήμα Βιολογίας, Παν. Πατρών), για το άν υπάρχει κάποια συσχέτιση μεταξύ της μεταφραστικής πιστότητας και του οξειδωτικού στρες στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε δύο καλά μελετημένα μεταλλαγμένα στελέχη S. cerevisiae στο Εργαστήριό μας με αντίθετες επιπτώσεις στη μεταφραστική ακρίβεια. Αυτά ήταν το sup45 μετάλλαγμα (επιρρεπές σε λάθη με συχνότητα λάνθασμένης ενσωμάτωσης αμινοξεών ίση προς 0,0166) καθώς και το τριπλό μετάλλαγμα sup45rdn4rdn6 (συχνότητα λάθους: 0,0057), στο οποίο γίνεται η επαναφορά της μεταφραστικής ακρίβειας στα επίπεδα των μορίων αγρίου τύπου (0,0036). Οι μεταλλάξεις rdn4 και rdn6 αφορούν στην έλικα 27 του 18S rRNA, ενώ η μετάλλαξη sup45 πρόκειται για μία κατασταλτική μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί για τον πράγοντα τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης eRF-1.
Οι οξειδωτικοί δείκτες που μετρήθηκαν ήταν η μαλονική διαλδεϋδη (MDA: κύριο προϊόν υπεροξείδωσης λιπιδίων), η οξειδωμένη γλουταθειόνη (GSSG), οξειδωμένα μη πρωτεϊνικά μόρια (NPSSR), καθώς και οξειδωμένα πρωτεϊνικά μόρια (PSSP). Οι αντιοξειδωτικοί δείκτες που μετρήθηκαν ήταν τα ανηγμένα πρωτεϊνικά μόρια που φέρουν ελεύθερες σουλφυδρυλομάδες (PSH), καθώς και το κλάσμα PSH/PSSP μέσα στα κυτταρικά εκχυλίσματα. Εν συντομία, το επιρρεπές σε λάθη κατα τη μετάφραση μετάλλαγμα sup45 μείωσε τα επίπεδα των οξειδωτικών δεικτών σε αντίθεση με το πιο ακριβές τριπλό μετάλλαγμα sup45rdn4rdn6, στο οποίο παρατηρήθηκε αύξηση των δεικτών αυτών. Περαιτέρω επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων αυτών προήλθε με την χρήση παρομομυκίνης κατά την ανάπτυξη των στελεχών αυτών (μειώνει τη μεταφραστική πιστότητα) και τη διεξαγωγή των μετρήσεων αυτών των δεικτών οξειδωτικού στρες εκ νέου. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων με χρήση PM έδειξαν στις περισσότερες περιπτώσεις σημαντική μείωση των επιπέδων οξειδωτικού στρες. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα του δεύτερου μέρους της Μεταπτυχιακής αυτής Διατριβής υποδηλώνουν ότι στα ευκαρυωτικά κύτταρα η μείωση της μεταφραστικής πιστότητας οδηγεί σε μείωση του οξειδωτικού στρες σε αυτά και το αντίστροφο.
|
|---|
