Κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός της πρωτεϊνικής υπομονάδας DPop5 του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της ριβονουκλεάσης Ρ από το Dictyostelium discoideum

• Κύριος συγγραφέας: Κοντοπούλου, Χρυσούλα
• Άλλοι συγγραφείς: Δραΐνας, Διονύσιος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2012
• Θέματα: Ριβονουκλεάση P; Ribonuclease P; DPop5; Dictyostelium discoideum; 572.884 5

Ο μυξομύκητας Dictyostelium discoideum είναι εξελικτικά κατώτερος ευκαρυωτικός οργανισμός και η RNase P από αυτόν είναι ένα εξαιρετικά ενδιαφέρον ένζυμο, δεδομένου του ότι, το ένζυμο αυτό προσφέρεται για σύγκριση, τόσο με ένζυμα RNase P ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, όσο και με τα καλύτερα χαρακτηρισμένα βακτηριακά ολοένζυμα. Η RNase P του D. discoideum έχει βρεθεί ότι είναι και αυτή ένα ριβονουκλεοπρωτεΐνικό σύμπλοκο, που αποτελείται από μία RNA υπομονάδα και από οχτώ πρωτεϊνικές υπομονάδες. Στην εργασία αυτή έγινε προσπάθεια να κλωνοποιηθεί και να χαρακτηριστεί μια επιπλέον πρωτεΐνική υπομονάδα, η DPop5, πέραν των τεσσάρων που έχουν ήδη κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί από το εργαστήριο του κ. Δραΐνα (DRpp20, DRpp30, DRpp40, DRpp29), έτσι ώστε να δοθεί επιπλέον πληροφορία για την ολοκλήρωση της αρχιτεκτονικής του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση του γονιδίου και υπερέκφραση αυτής μέσω ενός συστήματος έκφρασης, το οποίο βασίζεται στην παραγωγή χιμαιρικών πρωτεϊνών, αποτελούμενων από την πρωτεΐνη-στόχο και τη βακτηριακή συνοδό πρωτεΐνη, HSP70 ή DnaK. Στη συνέχεια, αφού ακολούθησε καθαρισμός της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της και η παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτής. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της καθώς και η μοντελοποίηση αυτής in silico έδειξαν ότι η πρωτεΐνη αυτή είναι αρνητικά φορτισμένη (pI 5.19) και ότι έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με RNA μόρια, μέσω ενός χαρακτηριστικού μοτίβου πρόσδεσης σ’ αυτά. Περαιτέρω πειραματικές διαδικασίες βρίσκονται σε εξέλιξη έτσι ώστε να αποσαφηνιστεί πλήρως ο ρόλος της στο ολοένζυμο.