Βιοχημική και μοριακή μελέτη των γλυκοζαμινογλυκανών και των ενζύμων μεταβολισμού τους στον καρκίνο

• Κύριος συγγραφέας: Καλαθάς, Δημήτριος
• Άλλοι συγγραφείς: Βύνιος, Δημήτριος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2012
• Θέματα: Γλυκοζαμινογλυκάνες; Χονδροϊτίνη; Glycosaminoglycans; Chondroitin; 572.566

Οι θειωμένες γλυκοζαμινογλυκάνες είναι σημαντικά μόρια του εξωκυττάριου χώρου που επιτελούν σημαντικές διεργασίες. Η βιοσύνθεσή τους επιτυγχάνεται με τη συμμετοχή πολλών ενζύμων που έχουν διάφορους ρόλους. Τα κυριότερα ένζυμα που βιοσυνθέτουν θειική χονδροϊτίνη/ δερματάνη είναι οι συνθάσες χονδροϊτίνης, οι γλυκοσυλοτρανσφεράσες, οι σουλφοτρανσφεράσες και η επιμεράση της θειικής δερματάνης. Οι συνθάσες χονδροϊτίνης έχουν διττό ρόλο, γιατί έχουν δύο ενεργά κέντρα: Το ένα προσθέτει γλυκουρονικό οξύ και το άλλο Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη στο μη αναγωγικό άκρο μιας νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Παράλληλα, οι σουλφοτρανσφεράσες προσθέτουν θειικά σε συγκεκριμένες θέσεις ενώ η επιμεράση μετατρέπει κατάλοιπα γλυκουρονικού σε ιδουρονικό πριν συμβεί θείωση του δισακχαρίτη. Οι συνθάσες χονδροϊτίνης είναι οι εξής: CHSY1, CHSY2 (CHPF) και CHSY3. Η γλυκουρονυλοτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης είναι η CSGlcA-T. Οι κυριότερες σουλφοτρανσφεράσες είναι οι C4ST1, D4ST1 και CHST3. Η μελέτη των ενζύμων αυτών στον καρκίνο είναι εξαιρετικού ενδιαφέροντος, γιατί έχει βρεθεί ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες συμμετέχουν στην ανάπτυξη του καρκίνου. Έχει παρατηρηθεί ότι οι γλυκοζάμινογλυκάνες υφίστανται ποιοτικές και ποσοτικές μεταβολές στους διάφορους καρκίνους. Οι μεταβολές αυτές φαίνεται να συμβάλλουν τόσο στην ανάπτυξη του καρκίνου όσο και στον φαινότυπό του. Η κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν στις μεταβολές των γλυκοζαμινογλυκανών είναι πολύ σημαντική. Η μελέτη επικεντρώθηκε στις μεταβολές που υφίστανται τα παραπάνω ένζυμα στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του λάρυγγα. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: RT-PCR ανάλυση έπειτα από απομόνωση ολικού RNA, Western blotting ύστερα από διαδοχική εκχύλιση με PBS, υδροχλωρική γουανιδίνη και υδροχλωρική γουανιδίνη Triton-X100 για τη διερεύνηση της έκφρασης των γονιδίων, μεθυλοειδική PCR (MSP) για τη διερεύνηση των επιγενετικών μηχανισμών μετά από απομόνωση DNA και μέτρηση της δραστικότητας C-4 σουλφοτρανσφεράσης με χρήση αποθειωμένης δερματάνης ως υπόστρωμα. Στα δείγματα του παχέος εντέρου, η έκφραση της συνθάσης χονδροϊτίνης Ι ήταν υψηλότερη στα πρώτα στάδια του καρκίνου. Επίσης, ήταν αρκετά υψηλή στα μακροσκοπικά φυσιολογικά δείγματα που είναι παρακείμενα στους καλοήθεις όγκους. Στους τελευταίους και στους υγιείς ιστούς δεν υπήρχε σημαντική έκφραση του ενζύμου. Όσον αφορά τον λάρυγγα η έκφραση ήταν υψηλή στα παθολογικά δείγματα και ελαφρώς χαμηλότερη στα υγιή. Τα φυσιολογικά δείγματα δεν παρουσίαζαν σημαντική έκφραση του ενζύμου. Ο παράγοντας πολυμερισμού της χονδροϊτίνης, είχε υψηλότερη έκφραση στα παθολογικά δείγματα σε σχέση με τα φυσιολογικά στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Επίσης, φαίνεται να αυξανόταν στα παθολογικά δείγματα με το στάδιο του καρκίνου. Η έκφρασή του στους υγιείς ιστούς και στους παρακείμενους μακροσκοπικά φυσιολογικούς ιστούς των αδενωμάτων ήταν περιορισμένη. Αντίθετα, στα λαρυγγικά δείγματα η έκφρασή του ήταν αυξημένη στους υγιείς ιστούς. Η γλυκουρονυλoτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης είχε περιορισμένη και σταθερή έκφραση στα πρώτα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου αλλά στα ανώτερα στάδια αυξανόταν στα παθολογικά δείγματα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στη έκφραση των γονιδίων συνθάση χονδροϊτίνης ΙΙΙ και 6-σουλφοτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου ή του λάρυγγα. Παρόλο αυτά, στον υγιή λάρυγγα τα δύο αυτά ένζυμα εκφράζονταν περισσότερο από τον καρκίνο. Το αντίθετο ισχύει για το υγιές παχύ έντερο που παρουσίαζε περιορισμένη έκφραση των δύο αυτών γονιδίων σε σχέση με τον καρκίνο. Τα επίπεδα mRNA της C-4 σουλφοτρανσφεράσης της θειικής δερματάνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου φαίνεται να μειώθηκαν με το στάδιο του καρκίνου αλλά τα επίπεδα της πρωτεΐνης ήταν σταθερά. Στην υγιή κατάσταση το ένζυμο υποεκφραζόταν αλλά το αντίθετο ίσχυε για τα λαρυγγικά δείγματα. Επίσης, η περιοχή του υποκινητή του γονιδίου που εξετάστηκε παρέμενε πλήρως αμεθυλίωτη τόσο στα λαρυγγικά όσο και στα δείγματα του παχέος εντέρου κάτι που σημαίνει ότι πιθανώς δεν υπάρχει ρύθμιση της έκφρασης με μηχανισμό μεθυλίωσης του υποκινητή. Τα επίπεδα mRNA της επιμεράσης της θειικής δερματάνης ήταν αυξημένα στα παθολογικά δείγματα στα ανώτερα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η έκφραση αυτή φαίνεται να επηρεάζεται από τη μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Στα λαρυγγικά δείγματα δεν έγινε ανίχνευσή της στα φυσιολογικά δείγματα παρά μόνο στα παθολογικά και σε μικρότρο βαθμό στα υγιή. Σε ορισμένα τουλάχιστον παθολογικά λαρυγγικά δείγματα φαίνεται να υπάρχει υπομεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Σε αυτό το σημείο φαίνεται να υπάρχει ομοιότητα στη ρύθμιση των διαφορετικών καρκίνων. Η εκχυλισιμότητα των ενζύμων στο PBS τόσο στα λαρυγγικά όσο και στα δείγματα του παχέος εντέρου κατέδειξε ότι ένα σημαντικό μέρος τους εκκρίνεται από τα κύτταρα. Σε προηγούμενες μελέτες η παρουσία τέτοιων ενζύμων (CHSY1, C4ST1 και D4ST1) στο θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών έχει ταυτοποιηθεί. Το ένζυμο που συγκρατείται περισσότερο και έχει τη μικρότερη παρουσία στον εξωκυττάριο χώρο είναι ο CHPF που εκχυλίζεται κυρίως στην GdnHCl. Επιπλέον, αξιοσημείωτη εκχυλισιμότητα τόσο στην GdnHCl όσο και την GdnHCl-Triton X100 παρουσίασε η CHSY1 η οποία ανιχνεύθηκε σε μεγάλη ποσότητα και στα εκχυλίσματα PBS. Όλα τα υπόλοιπα ένζυμα βρέθηκαν κυρίως σε εκχυλίσματα PBS (CHST3, D4ST1, C4ST1 και CHSY3). Τέλος, μελετήθηκαν και κάποια άλλα μόρια στον καρκίνο του παχέος εντέρου-υποστρώματα των ενζύμων- για να εξεταστεί η πιθανή συσχέτισή τους με την έκφραση των ενζύμων: Τα επίπεδα mRNA της διακοσμητίνης, ήταν υψηλότερα στους υγιείς ιστούς. Στον καρκίνο, σε όλα τα φυσιολογικά δείγματα η έκφρασή της ήταν αυξημένη σε σχέση με τα παθολογικά. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης με το στάδιο του καρκίνου τόσο στα φυσιολογικά όσο και τα παθολογικά δείγματα. Η ισομορφή V0 της βερσικάνης ήταν αυξημένη στον καρκίνο (στα ίδια επίπεδα ανάμεσα στους φυσιολογικούς και τους αντίστοιχους παθολογικούς ιστούς) σε σχέση με την υγιή κατάσταση. Με το στάδιο υπήρχε αύξηση. Αντίθετα η ισομορφή V1 της βερσικάνης είχε τα υψηλότερα επίπεδα mRNA στα υγιή δείγματα και ταυτόχρονα υπήρχε μείωση με το στάδιο τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα παθολογικά δείγματα. Οι ισομορφές V2 κια V3 ήταν στα ίδια επίπεδα στους υγιείς, φυσιολογικούς και παθολογικούς ιστούς και δεν παρατηρήθηκε καμία διαφοροποίηση στην έκφρασή τους με το στάδιο του καρκίνου. Από προηγούμενες μελέτες στον καρκίνο του λάρυγγα έχει παρατηρηθεί ότι με το στάδιο του καρκίνου υπάρχει συνεχής μείωση της θειικής χονδροϊτίνης και της θειικής δερματάνης σε σχέση με την υγιή κατάσταση. Πιο συγκεκριμένα υπάρχει δραματική μείωση με το στάδιο της C-6 θείωσης ενώ η μείωση της C-4 θείωσης γίνεται βαθμιαία. Η γενική μείωση της θειικής χονδροϊτίνης και θεικής δερματάνης μπορεί να εξηγηθεί από τη μεγάλη μείωση που παρατηρήθηκε στον CHPF και την CHSY3 στον καρκίνο σε σχέση με τον υγιή λάρυγγα. Η αμυδρή αύξηση της CHSY1 και της CSGlcA-T δεν μπορούν να οδηγήσουν σε αύξηση της CS/ DS. Επιπλέον, η μείωση της CHST3 στον καρκίνο πρέπει να οδηγεί και στην σχετική μείωση της C-6 θείωσης. Επίσης, είναι γνωστό ότι η CHSY1 ευνοεί περισσότερο τη C-4 θείωση τόσο στην χονδροϊτίνη όσο και στην δερματάνη. Η αυξημένη C-4 θείωση πρέπει να οφείλεται σε θειική χονδροϊτίνη, γιατί ενώ η D4ST1 μειωνόταν σε σχέση με την υγιή κατάσταση η C4ST1 αυξανόταν. Επιπλέον, ο CHPF που επίσης μειωνόταν στον καρκίνο ευνοεί περισσότερο τη C-6 θείωση. Σε αυτό το σημείο πρέπει να αναφερθεί ότι τα καλύτερα υποστρώματα για όλες τις συνθάσες χονδροϊτίνης είναι η αθείωτη πολυμερής χονδροϊτίνη και η CSC. Σε προηγούμενες μελέτες που αφορούν τον καρκίνο του παχέος εντέρου έχει παρατηρηθεί αύξηση της C-6 θείωσης και σχετική μείωση της C-4 θείωσης. Η C-6 θείωση φαίνεται να αυξάνεται και με το στάδιο του καρκίνου ενώ η C-4 θείωση τείνει να μειώνεται. Τα αποτελέσματα αυτά μπορούν να εξηγηθούν από τη μείωση της CHSY1 και της C4ST1 στα ανώτερα στάδια καθώς και στην ταυτόχρονη αύξηση του CHPF. Είναι αξιοσημείωτο το ότι δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στα επίπεδα πρωτεΐνης με το στάδιο του καρκίνου στην CHST3 ή την D4ST1. Παρόλο αυτά, στην υγιή κατάσταση (όπου η παρουσία χονδροϊτίνης-δερματάνης είναι περιορισμένη) τα ένζυμα εκφράζονταν ελάχιστα. Επιπλέον, τα επίπεδα του miR124 ήταν σταθερά. Συμπερασματικά, τα γονίδια βιοσύνθεσης των θειωμένων γλυκοζαμινογλυκανών υφίστανται μεταβολές στην έκφρασή τους στον καρκίνο του παχέος εντέρου συμμετέχοντας στην ογκογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου. Έτσι, πρωτεογλυκάνες που περιέχουν γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες με συγκεκριμένες ιδιότητες επηρεάζουν την κυτταρική σηματοδότηση. Η διαλεύκανση των μηχανισμών που επηρεάζουν την έκφραση των βιοσυνθετικών ενζύμων των γλυκοζαμινογλυκανών είναι μεγάλης σημασίας.