Μοριακός έλεγχος τού λείου μυϊκού φαινότυπου

• Κύριος συγγραφέας: Μυρίσσα, Αναστασία
• Άλλοι συγγραφείς: Τοπούζης, Σταύρος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2013
• Θέματα: Λείος μυϊκός φαινότυπος; Αδρενεργικοί υποδοχείς; Smooth muscle phenotype; Adrenergic receptors; 612.740 45

Ο Λείος Μυϊκός Φαινότυπος (ΛΜΦ) χαρακτηρίζεται από σημαντική πλαστικότητα και παίζει κομβικό λειτουργικό ρόλο τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Στις αρτηρίες, η μεταβολή του ΛΜΦ στο φάσμα από φυσιολογικός-συσταλτός μέχρι συνθετικός-παθολογικός εμπλέκεται αιτιολογικά σε διάφορες ανθρώπινες ασθένειες όπως στην αθηροσκλήρωση, στην υπέρταση και στην επαναστένωση των αγγείων μετά από εγχείρηση. Η έκφραση γονιδίων ΛΜΦ έιναι επίσης μεγάλης σημασίας σε ασθένειες άλλων οργάνων, όπως η ίνωση των νεφρών και του ήπατος και η μετάσταση του καρκίνου. Συνεπώς, η μελέτη των μοριακών μηχανισμών μέσω των οποίων επηρεάζεται ο ΛΜΦ είναι πολύ σημαντική για την ανάπτυξη νέων τεχνικών περιορισμού της εξέλιξης αυτών των νόσων. Η λειτουργία πολλών ιστών όπως είναι τα αγγεία ελέγχεται σε σημαντικό βαθμό από το συμπαθητικό νευρικό σύστημα. Σκοπός λοιπόν της παρούσας εργασίας ήταν πρώτα-πρώτα να εξετάσουμε εάν in vitro η διέγερση των α και β αδρενεργικών υποδοχέων πιθανώς ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων ΛΜΦ και προκαταρκτικά να διακριβώσουμε μέσω ποιών μοριακών μηχανισμών οι α1 (υπότυποι α1Α και α1Β) και οι β-ΑΥς επηρεάζουν και ελέγχουν το ΛΜΦ. Κατά δεύτερο λόγο θελήσαμε να εξετάσουμε εάν η εξωγενής έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Μυοκαρδίνη προκαλεί επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ-Epithelial to Mesenchymal Transition) σε ενδοθηλιακά κύτταρα in vitro. Για τα πρώτα πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς: α) διαφοροποιημένα λεία μυϊκά κύτταρα αορτής αρουραίου της κυτταρικής σειράς A7r5, και β) κύτταρα ινοβλαστών της κυτταρικής σειράς ΝΙΗ3Τ3 προερχόμενα απο ποντικό, προκειμένου να δούμε αντίστοιχα πως η δράση των ΑΥ ελέγχει την έκφραση των γονιδίων αυτών σε διαφοροποιημένα ΛΜΚ (A7r5) και σε αδιαφοροποίητα κύτταρα που όμως μπορούν να μετατραπούν σε «ΛΜΚ» (ΝΙΗ3Τ3). Ως δείκτη για την έκφραση του ΛΜΦ, εξετάσαμε την έκφραση κυτταροσκελετικών, δομικών πρωτεϊνών-δεικτών, όπως η λείου μυϊκού τύπου α-Ακτίνη (SM-α-Αctin),, η λείου μυϊκού τύπου βαριά αλυσίδα της Μυοσίνης (SM-MHC), η λείου μυϊκού τύπου Καλπονίνη (SM-Calponin) και η λείου μυϊκού τύπου πρωτεΐνη 22α (τρανσγελίνη) (SM22α), σε δύο επίπεδα: α) είτε χρησιμοποιώντας αντισώματα, είτε β) με την χρήση πλασμιδίων αναφοράς όπου minimal υποκινητές των παραπάνω γονιδίων ελέγχουν την προσμετρούμενη έκφραση λουσιφεράσης. Η ενεργοποίηση της μεταγραφής αυτών των γονιδίων ρυθμίζεται, σε μεγάλο μέρος, από τις αλληλουχίες CArG (CArG boxes) στους υποκινητές τους, στις οποίες προσδένεται ο παράγοντας Serum Response Factor (SRF). Στα ΛΜΚ, ο μεταγραφικός παράγοντας SRF ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών μέσω δημιουργίας ενός απαραίτητου συμπλόκου με έναν μεταγραφικό παράγοντα της οικογένειας των Μυοκαρδινών, η οποία αποτελείται από 3 μέλη : τη Μυοκαρδίνη και τις συγγενείς πρωτεΐνες MRTF-A και MRTF-B. Στη μελέτη που πραγματοποιήσαμε, αρχικά παρατηρήσαμε ότι οι δύο αυτοί κυτταρικοί πληθυσμοί δεν εκφράζουν τους α1-ΑΥς (α1Α και α1Β υπότυποι) ενδογενώς, αλλά, με εισαγωγή του αντίστοιχου πλασμιδίου των α1Α ή α1Β ΑΥς, το σύστημα καθίσταται λειτουργικό. Επιπλέον ανακαλύψαμε ότι τα κύτταρα A7r5 εκφράζουν ενδογενώς τους β-ΑΥς. Από τα πειράματα που πραγματοποιήσαμε, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι οι υποδοχείς αυτοί επηρεάζουν και καθορίζουν με διαφορετικό τρόπο το ΛΜΦ, ανάλογα με τον υπότυπο των ΑΥς και ανάλογα με τον τύπο των κυττάρων. Πιο αναλυτικά, όσον αφορά στα κύτταρα A7r5 παρατηρήσαμε ότι: α) η ενεργοποίηση των α1Α-ΑΥ επάγει την έκφραση και των τεσσάρων γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, β) η ενεργοποίηση του υποκινητή της SM22α από τους α1Α-ΑΥς εξαρτάται από τα στοιχεία CΑrG ενώ η ενεργοποίηση του υποκινητή της SM-Calponin δεν εξαρτάται από τα στοιχεία αυτά, γ) η ενεργοποίηση των α1Β-ΑΥ επάγει τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α και SM-Calponin ενώ δεν επηρεάζει την μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM-α-Αctin και της SM-MHC, δ) η ενεργοποίηση των υποκινητών της SM22α και της SM-Calponin από τους α1Β-ΑΥς εξαρτάται από τα στοιχεία CΑrG, ε) οι β-ΑΥς, σε αντίθεση με τους α1-ΑΥς, επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο τη μεταγραφή των γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ, κυρίως ελαττώνοντας τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM-Calponin, SM-α-Αctin και SM-MHC ενώ δεν επηρεάζουν τη μεταγραφική ενεργότητα του SM22α. Επίσης, όταν παρόμοια πειράματα έγιναν στα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 παρατηρήσαμε ότι: α) οι α1Α-ΑΥs επάγουν τη μεταγραφή των υποκινητών και των τεσσάρων γονιδίων-δεικτών που καθορίζουν το ΛΜΦ, β) στα κύτταρα αυτά η ενεργοποίηση των υποκινητών της SM22α και της SM-Calponin από τους α1Α-ΑΥς δεν εξαρτάται από τα στοιχεία CΑrG, γ) η ενεργοποίηση των α1Β-ΑΥs επάγει τη μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών των γονιδίων SM22α, SM-Calponin και SM-MHC ενώ δεν επηρεάζει την ενεργότητα του υποκινητή της SM-α-Αctin. Από τα παραπάνω λοιπόν, καταλήξαμε στα εξής συμπεράσματα: 1) Η διέγερση των α1-ΑΥ οδηγεί σε άυξηση της έκφρασης των γονιδίων-δεικτών του ΛΜΦ, και άρα οι α1-ΑΥς λειτουργούν, τουλάχιστον in vitro, ως παράγοντες προώθησης του ΛΜΦ. 2) Η δράση των α1-ΑΥ εξαρτάται μόνο μερικώς απο την ύπαρξη στοιχείων CArG (SRE), και διαφέρει ανάλογα με τον υποκινητή, άρα οι διάφοροι υποκινητές χρησιμοποιούν διαφορετικά τα στοιχεία CArG που περιέχουν, πράγμα που ενισχύει την υπόθεση συνδυαστικής χρήσης μεταφραφικών παραγόντων για την «πλαστική» έκφραση του λειτουργικού ΛΜΦ. 3) Οι δύο υπότυποι των α1-ΑΥ που εξετάστηκαν, α1Α-ΑΥς και α1Β-ΑΥς, έχουν προφανείς διαφορές ως πρός την διέγερση της έκφρασης των ΛΜ γονιδίων, και άρα πιθανώς θα παίζουν διαφορετικό λειτουργικό ρόλο στα αγγεία και στους άλλους ιστούς όπου εκφράζονται. 4) Αντίθετα με τους α1-ΑΥς, οι β-ΑΥς λειτουργούν ανασταλτικά στην έκφραση των γονιδίων του ΛΜΦ, και άρα το τελικό προϊόν της συμπαθητικής διέγερσης στα αγγεία θα είναι η συνισταμένη των δράσεων α και β ΑΥ, που θα διαφέρει στα διάφορα αγγεία ανάλογα με την σχετική έκφραση των υποδοχέων αυτών. Παράλληλα, εξετάζοντας ενδοθηλιακά κύτταρα φλέβας ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC), είδαμε ότι η εξωγενής έκφραση της Μυοκαρδίνης προκαλεί αλλαγές στο φαινότυπό τους, τόσο σε μορφολογικό επίπεδο όσο και μέσω de novo έκφρασης της SM-α-Ακτίνης και της SM-Καλπονίνης σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Παρατηρήσαμε δηλαδή αλλαγές που είναι συμβατές με την επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ-Epithelial to Mesenchymal Transition), διαδικασία με πολύ σπουδαίο ρόλο στην εμβρυογένεση, στη διαμόρφωση ιστών και οργάνων, αλλά επίσης και στην ίνωση, στη μετάσταση του καρκίνου και στην παθολογική αγγειογένεση. Συμπερασματικά, τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων συμμετέχουν στη μετάβαση αυτή και μπορεί να συμβάλλουν σε διεργασίες κυτταρικής διαφοροποίησης και ιστικής δόμησης. Συμπεραίνουμε ότι η έκφραση της Μυοκαρδίνης επαρκεί για να προκαλέσει ΕΜΤ σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα, με πιθανές συνέπειες για τη δυνατότητα trans-διαφοροποίησης και συνεισφοράς αυτών των κυττάρων, σε ανακατασκευή και αναδιοργάνωση ιστών, όπως πχ. στην αθηροσκλήρωση και την καρδιακή ανεπάρκεια.