| Περίληψη: | Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι ομο- ή ετεροπενταμερείς διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες, σχηματίζοντας ιοντικά κανάλια, συμβάλλουν στην λειτουργία του μυικού και νευρικού συστήματος. Η επικείμενη εμπλοκή των υποδοχέων αυτών σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις του οργανισμού, επιβάλλει τη γνώση της δομής τους, απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη εξειδικευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων.
Μέχρι τώρα, δεν έχουν δημοσιευτεί υψηλής ανάλυσης πληροφορίες για τη δομή του μορίου του ανθρώπινου υποδοχέα μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ ή μέσω πειραμάτων πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Η απουσία των συγκεκριμένων πληροφοριών, οφείλεται στη φύση του μορίου του υποδοχέα όπως η ύπαρξη των υδρόφοβων διαμεμβρανικών περιοχών, το μέγεθος του μορίου καθώς και η αδυναμία απομόνωσης σε μεγάλες ποσότητες από φυσικές πηγές.
Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο να προκύψουν πρωτεϊνικά μόρια υδατοδιαλυτά, λειτουργικά, με δομή η οποία να πλησιάζει αρκετά τη φυσική διαμόρφωσή τους και σε ποσότητες ικανές ώστε να είναι εφικτές οι δομικές μελέτες τους. Τα τμήματα του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, τα οποία συγκεντρώνουν τις παραπάνω προϋποθέσεις, είναι τα εξωκυτταρικά αμινοτελικά πολυπεπτίδια των διαφόρων υπομονάδων που τον αποτελούν. Από την άλλη πλευρά, ο οργανισμός που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ως σύστημα ετερόλογης έκφρασης, πρέπει να είναι εύκολος στους χειρισμούς του, γρήγορος, οικονομικός, με μεγάλο επίπεδο έκφρασης (όπως τα βακτήρια π.χ. E.coli) αλλά ταυτόχρονα να έχει την ικανότητα να πραγματοποιεί μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις στις πρωτεΐνες που εκφράζει ώστε τα παραγόμενα μόρια να μπορούν να αναδιπλωθούν (όπως τα ευκαρυωτικά κύτταρα). Άρα, για να προκύψουν τα επιθυμητά μόρια, σύμφωνα με τις παραπάνω προϋποθέσεις, εκφράστηκαν τα εξωκυτταρικά τμήματα (ECDs) των ανθρώπινων υπομονάδων α1, α4 και β2 στο υπερκείμενο καλλιέργειας του μεθυλοτροφικού ζυμομύκητα P. pastoris.
Αρχικά, μελετήθηκαν τα εξωκυτταρικά τμήματα των α4 και β2 υπομονάδων με διαφορετικούς επιτόπους ώστε να γίνει η επιλογή του καλύτερου συνδιασμού που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για έκφραση των δύο υπομονάδων στο ίδιο σύστημα. Η έκφραση των α4 και β2 ECDs με τον επίτοπο των έξι αμινοξικών καταλοίπων στο καρβοξυτελικό τους άκρο (α4-ECD-6xHis και β2-ECD-6xHis) στο υπερκείμενο καλλιέργειας του P. pastoris, κατέληξε στην απομόνωση μικρών ποσοτήτων πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων τα οποία κρίνονται ακατάλληλα για δομικές μελέτες εξαιτίας της υδροφοβικότητας και κατά συνέπεια του μεγέθους τους. Όταν πραγματοποιήθηκε αλλαγή της υδρόφοβης περιοχής μεταξύ των κυστεινών 128 και 142 με την αντίστοιχη υδρόφιλη ολιγοπεπτιδική αλληλουχία της πρωτεΐνης η οποία δεσμεύει ακετυλοχολίνη (AChBP) στις ανασυνδιασμένες πρωτεΐνες, παρατηρήθηκε αισθητή βελτίωση για την β2-ECD υπομονάδα (β2-cysloop-ECD-6xHis) τόσο σε επίπεδο έκφρασης όσο και στο μέγεθος το οποίο σχηματίζει. Ωστόσο, παρόμοια βελτίωση για την α4-cysloop-ECD-6xHis υπομονάδα, παρατηρήθηκε όταν αντικαταστάθηκε ο καρβοξυτελικός επίτοπος των έξι αμινοξικών καταλοίπων ιστιδίνης από τον επίτοπο του οκταπεπτιδίου FLAG (α4-cysloop-ECD-FLAG).
Στα πειράματα συνέκφρασης, των δύο υπομονάδων στο ζυμομύκητα P. pastoris που ακολούθησαν, αρχικά πιστοποιήθηκε η συνέκφραση και στη συνέχεια ο σχηματισμός ετεροπολυμερούς των δύο υπομονάδων. Ακόμα, η απογλυκοζυλίωση των α4-cysloop-ECD-FLAG και β2-cysloop-ECD-6xHis όταν εκφράζονται μόνες τους ή όταν εκφράζονται ταυτόχρονα στο υπερκείμενο του P. pastoris, φανέρωσε την αύξηση της ομοιογένειας των μορίων τους. Επιπλέον, ενθαρυντική ήταν η εύρεση της επιθυμητής στοιχειομετρίας 2 α4/ 3 β2 των υπομονάδων βάση της οποίας συμμετέχουν στο σχηματισμό του ετεροπολυμερούς.
Ωστόσο, η μάζα του ετεροπολυμερούς των ανασυνδιασμένων α4 και β2 υπομονάδων, όπως προέκυψε από την επεξεργασία των αποτελεσμάτων της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης (1191 και 496kDa), απέχει κατά πολύ από την θεωρητικά αναμενόμενη μάζα ετεροπενταμερούς των 175kDa. Μελέτες δυναμικής σκέδασης φωτός σε δείγματα του απομονωμένου ετεροπολυμερούς, επιβεβαίωσαν το παραπάνω αποτέλεσμα. Τα αποτελέσματα της μελέτης μείωσης του μεγέθους των ετεροπολυμερών με απορρυπαντικά, έδειξαν ότι είναι δυνατή η επιθυμητή μείωση του μεγέθους αλλά σε υψηλές τιμές συγκεντρώσεων απορρυπαντικού. Επιπλέον, η ανάγκη για ακόμα υψηλότερες τιμές απορρυπαντικών προς βελτίωση της ομοιογένειας δεν συνίσταται, διότι κατευθύνει τους σχηματισμούς των πρωτεϊνικών μοριών σε ασταθείς καταστάσεις οι οποίες χαρακτηρίζονται από ευμετάβλητες διαμορφώσεις και πολλές φορές καταστροφή των υπό μελέτη πρωτεϊνών.
Ακόμα, το γεγονός ότι τα απομονωμέμενα ετεροπολυμερή των α4 και β2 ECDs δεν εμφανίζουν την ικανότητα δέσμευσης νικοτίνης, σε συνδιασμό με τα παραπάνω αποτελέσματα μελέτης τους, οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι δεν τηρούν τις προϋποθέσεις των κατάλληλων πρωτεϊνικών δειγμάτων τα οποία προορίζονται για πειράματα μελέτης της δομής τους.
Η έκφραση της ανασυνδιασμένης α1-ECD με τον επίτοπο των έξι αμινοξικών καταλοίπων στο καρβοξυτελικό της άκρο (α1-ECD-6xHis) στο υπερκείμενο καλλιέργειας του P. pastoris, κατέληξε στην απομόνωση υδατοδιαλυτού και λειτουργικού μορίου. Οι πληροφορίες των μελετών κυκλικού διχρωισμού σε δείγμα της απομονωμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης, δείχνουν ότι πρόκειται για ένα μόριο με διαμόρφωση και μάλιστα, σε επίπεδο δευτεροταγούς δομής, εμφανίζει ένα πλούσιο περιεχόμενο β-πτυχωτής επιφάνειας (40,9%). Ωστόσο, οι δοκιμές κρυστάλλωσης στις οποίες τέθηκαν δείγματα της α1-ECD-6xHis, δεν απέδωσαν το επιθυμητό αποτέλεσμα της κρυστάλλωσης του μορίου. Ακόμα και όταν πραγματοποιήθηκε προσπάθεια μελέτης του μορίου σε διαλύματα (NH4)2SO4 με μεταβλητή συγκέντρωση, pH και θερμοκρασία, στάθηκε αδύνατο να κρυσταλλωθεί το μόριο. Το πρόβλημα της συγκεκριμένης έκφρασης, εντοπίστηκε επιπλέον και στο ποσό της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης που είναι δυνατόν να απομονωθεί. Για να αυξηθεί το επίπεδο έκφρασης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα μεταβολής των συνθηκών καλλιέργειας (θερμοκρασία, σύσταση θρεπτικού μέσου) όπως επίσης και των συνθηκών απομόνωσης. Παρατηρήθηκε βελτίωση στην ποσότητα του τελικού απομονωμένου προϊόντος η οποία όμως δεν θεωρείται ικανοποιητική.
Για το λόγο αυτό, στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έκφραση και απομόνωση της α1-ECD με τον επίτοπο του οκταπεπτιδίου FLAG στο αμινοτελικό της άκρο, στο υπερκείμενο καλλιέργειας του ίδιου ζυμομύκητα. Το επίπεδο έκφρασης της συγκεκριμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης, ήταν αρκετά ικανοποιητικό (1mg πρωτεΐνης /lt υπερκειμένου καλλιέργειας) και μάλιστα αυξημένο κατά πολύ σε σχέση με τις προηγούμενες εκφράσεις (0,34mg πρωτεΐνης /lt υπερκειμένου καλλιέργειας). Ωστόσο, η αδυναμία ορθής λήψης φάσματος του μορίου μέσω κυκλικού διχρωισμού εξαιτίας αυξημένου θορύβου, στάθηκε η αιτία να σταματήσει η έκφραση της συγκεκριμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης.
|
|---|
