| Περίληψη: | Είναι ευρέως αποδεκτό και καλά τεκμηριωμένο ότι ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (epidermal growth factor receptor, EGFR) ελέγχει σημαντικές λειτουργίες των καρκινικών κυττάρων, όπως τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, αλλά και διαδικασίες όπου συμμετέχουν περισσότεροι του ενός τύποι κυττάρων, όπως τη διήθηση και την αγγειογένεση. Μεταξύ των τύπων καρκίνου, στην ανάπτυξη των οποίων συμμετέχει ο EGFR, είναι και ο μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (ΜΜΚΠ). Πολύ πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι ένα άλλο μόριο που εμπλέκεται στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα είναι το Notch. Ο ρόλος του είναι περίπλοκος και διττός: Έχει προταθεί ότι το Notch επάγει την ανάπτυξη του ΜΜΚΠ και αναστέλλει την ανάπτυξη του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (ΜΚΠ). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι το μονοπάτι μεταγωγής σήματος του Notch επηρεάζει, αλλά και επηρεάζεται από άλλα μόρια. Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία διερευνήθηκε ο ρόλος του EGFR και του Notch στην ανάπτυξη κυττάρων ΜΜΚΠ χρησιμοποιώντας τον προσδέτη του EGFR, EGF και τον αναστολέα της γ-σεκρετάσης DAPT.
Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές ΜΜΚΠ Η23, Α549, Η661 και ΗCC827. Οι κυτταρικές σειρές Η23, Α549 και Η661 εκφράζουν τον αγρίου τύπου (wild type, wt) EGFR και η κυτταρική σειρά HCC827 εκφράζει EGFR που φέρει τη μετάλλαξη (mutation) (DE746- A750). Αρχικά με ανάλυση κατά western μελετήθηκε το προφίλ των κυττάρων ως προς τα επίπεδα έκφρασης του ενδοκυττάριου τμήματος του Notch (Notch Intracellular Domain, NICD). Βρέθηκε ότι τα κύτταρα Η23 εκφράζουν τα υψηλότερα επίπεδα Notch ICD, τα κύτταρα Η661 και HCC827 μέτρια επίπεδα και τα κύτταρα Α549 τα χαμηλότερα. Στη συνέχεια με τη μέθοδο του ΜΤΤ έγινε έλεγχος του DAPT στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και βρέθηκε ότι τα κύτταρα Η661 είχαν τη μεγαλύτερη αναστολή, παρόμοια συμπεριφορά έδειξαν και τα Α549. Τα κύτταρα Η23 εμφάνισαν μικρότερη ανταπόκριση σε σχέση με τα Η661 ενώ τα κύτταρα HCC827 εμφανίστηκαν ανθεκτικά στο DAPT. Η ανασταλτική δράση του DAPT στα κύτταρα Η661 συνοδεύτηκε με επαγωγή της απόπτωσης η οποία προσδιορίστηκε με τη μέθοδο αννεξίνης V καθώς και με επαγωγή της αυτοφαγίας η οποία ανιχνεύτηκε κάνοντας ανάλυση κατά western για τα πρωτεϊνικά επίπεδα της beclin-1. Περαιτέρω τα κύτταρα ενεργοποιήθηκαν με EGF και εν συνεχεία προστέθηκε DAPT. Παρατηρήθηκε ότι στα κύτταρα Η23 η προσθήκη του EGF δεν επέτρεψε να δράσει ανασταλτικά το DAPT ενώ στα Η661 εν μέρει ο EGF αντέστρεψε την ανασταλτική δράση του DAPT. Επιλέγοντας τις κυτταρικές σειρές Η23 και Η661, μελετήθηκε η δράση του DAPT και του EGF στα επίπεδα του Notch ICD. Παρατηρήθηκε ότι στα κύτταρα Η23, το DAPT μείωσε με χρονοεξαρτώμενο τρόπο τα πρωτεϊνικά επίπεδα του Notch ICD μέχρι και 6 ώρες μετά την προσθήκη του στα κύτταρα ενώ 24 ώρες μετά το φαινόμενο αντιστράφηκε. Η προσθήκη του EGF δεν επηρέασε τα επίπεδα του Notch ICD σε καμία από τις χρονικές στιγμές που μελετήθηκαν. Στα Η661 κύτταρα το DAPT προκάλεσε χρονοεξαρτώμενη μείωση των επιπέδων Notch ICD η οποία διήρκησε μέχρι και 24 ώρες μετά τη προσθήκη του DAPT. Ο EGF όπως και προηγουμένως δεν επηρέασε τα επίπεδα του Notch ICD. Παρατηρώντας ότι στα Η661 το DAPT ασκεί δράση με μεγαλύτερη διάρκεια σε σχέση με τα κύτταρα Η23, τα κύτταρα Η661 ενεργοποιήθηκαν με EGF και στη συνέχεια προστέθηκε το DAPT προκειμένου να δούμε τη δράση του συνδυασμού στα επίπεδα του Notch ICD. Βρέθηκε ότι ο EGF αντέστρεψε την μείωση των Notch ICD επιπέδων που προκαλεί μόνο του το DAPT.
Τα αποτελέσματα αναδεικνύουν ότι τα μονοπάτια του EGFR και του Notch, συνηγορούν προς την ίδια κατεύθυνση για τη μείωση του όγκου και αυτό υποδηλώνει έναν ελκυστικό δρόμο συνδυαστικών προσεγγίσεων για τη θεραπεία του ΜΜΚΠ, που μπορεί να ενισχύσει τη δράση των ανασταλτικών παραγόντων του EGFR σε όγκους.
Συμπερασματικά, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι στο ΜΜΚΠ: α) τα δύο μονοπάτια EGFR και Notch συνεπικουρούν για την ανάπτυξη του όγκου, β) η αναστολή του Notch είναι πιο αποτελεσματική σε κύτταρα με ενδιάμεσα επίπεδα ενεργού Notch 1, προκαλώντας τόσο απόπτωση όσο και αυτοφαγία, και γ) η μετάλλαξη του EGFR προσφέρει αντίσταση στη δράση αναστολέα της γ-σεκρετάσης.
|
|---|
