| Περίληψη: | Οι α7 και α9 υπομονάδες των νικοτινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης (nAChRs) είναι
οι μόνες, ανάμεσα σε μια μεγάλη ποικιλία υπομονάδων του ανθρώπινου nAChR, που
σχηματίζουν ομοπενταμερείς υποδοχείς. Για την θεραπεία διαφόρων νευρολογικών
διαταραχών αλλά και άλλων ασθενειών, όπου εμπλέκονται οι α7 και α9 nAChRs,
απαιτούνται φαρμακευτικές ουσίες που θα στοχεύουν ειδικά σε έναν υπότυπο των nAChRs.
Για τον σχεδιασμό τέτοιων φαρμάκων είναι ουσιώδης η διαλεύκανση σε ατομικό επίπεδο
της δομής του nAChR. Εντούτοις, η κρυστάλλωση ολόκληρων των διαμεμβρανικών
υποδοχέων, αλλά ακόμη και η έκφραση και απομόνωσή τους, σε βαθμό που να επιτρέπει
δομικές μελέτες, έχει αποδειχθεί δύσκολος στόχος. Η δυσκολία έγκειται κυρίως στην
παρουσία υδρόφοβων διαμεμβρανικών περιοχών και στην μεγάλη ενδοκυττάρια περιοχή
που θεωρείται ευκίνητη και ότι δεν έχει σταθερή διαμόρφωση.
Στο πλαίσιο αυτό, στοχεύσαμε στην παραγωγή τμημάτων των α7 και α9 υπομονάδων
του nAChR, που να είναι κατάλληλα για αναλυτικές δομικές μελέτες, σχεδιάζοντας
κατασκευές για την έκφραση των εξωκυτταρικών περιοχών των δύο υπομονάδων ή και
κολοβών διαμεμβρανικών μορφών της α7 υπομονάδας. Σε αυτές έχουν απαλειφθεί είτε
τμήματα της μεγάλης ενδοκυτταρικής περιοχής, είτε ολόκληρη αυτή η περιοχή και μεγάλα
τμήματα της διαμεμβρανικής περιοχής.
Στο παρελθόν, είχε εκφραστεί η α7-ΕΚΠ στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης Pichia
pastoris και είχε οδηγήσει σε συσσωματώματα μεγάλου μοριακού βάρους, ενώ η έκφραση
ενός μεταλλάγματος της α7-ΕΚΠ έδειξε σημαντική βελτίωση της υδροφιλικότητας του
μορίου και σχηματισμό ολιγομερών κυρίως πενταμερών μορίων (Zouridakis et al. 2009). Σε
αυτήν την εργασία, έχουμε επιτύχει να απομονώσουμε τα σχηματιζόμενα πενταμερή μόρια
αυτού του μεταλλάγματος, εκμεταλλευόμενοι την ιδιότητα τους να εκλούονται σε μεγάλο
εύρος συγκέντρωσης ιμιδαζολίου, κατά την χρωματογραφία συγγένειας. Ακόμη, η ενζυμική
απογλυκοζυλίωση του μεταλλάγματος αυτού, βοήθησε στην περαιτέρω μείωση της
ετερογένειας των απομονωμένων πενταμερών μορίων. Αν και ο αρχικός έλεγχος συνθηκών
κρυστάλλωσης των γλυκοζυλιωμένων πενταμερών μορίων οδήγησε στον σχηματισμό
μικροκρυστάλλων, δεν στάθηκε δυνατή η βελτιστοποίηση της ανάπτυξής τους.
Η έκφραση της αγρίου τύπου εξωκυτταρικής περιοχής της α9 υπομονάδας του
ανθρώπινου nAChR (α9wt) στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης P. pastoris, οδήγησε στην
παραγωγή κυρίως μονομερών μορίων που διαχωρίζονται εύκολα από τα σχηματιζόμενα
ολιγομερή. Η μονομερής μορφή της α9wt έδειξε αξιοσημείωτη διαλυτότητα, σταθερότητα και ομοιογένεια καθώς και ικανότητα πρόσδεσης της α-μπουγκαροτοξίνης, έναν ειδικό
ανταγωνιστή του μυικού και των ομοπενταμερών νευρικών nAChRs.
Προκειμένου να υποβοηθηθεί η συναρμολόγηση των εκφραζόμενων α7 και α9 ΕΚΠ
προς τον σχηματισμό πενταμερών μορίων, σχεδιάσαμε μεταλλάξεις που στηρίχθηκαν σε
τρισδιάστατα μοντέλα ομολογίας (3D homology modelling) αυτών, χρησιμοποιώντας ως
πρότυπο την κρυσταλλική δομή της ομόλογης, διαλυτής πρωτεΐνης δεσμεύσεως της
ακετυλοχολίνης (AChBP) από το μαλάκιο Lymnaea stagnalis. Οι μεταλλαγές αυτές έγιναν
είτε σε υδρόφοβα επιφανειακά αμινοξικά κατάλοιπα, με στόχο να αυξήσουμε την
υδροφιλικότητα του μορίου, είτε σε κατάλοιπα που εντοπίζονται στις διεπιφάνειες μεταξύ
δύο πρωτομερών, ώστε να ενισχύσουμε τις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις και να
υποβοηθήσουμε την συναρμολόγηση τους προς πενταμερή μόρια. Τα προκύπτοντα
μεταλλάγματα έχουν ταύτιση αμινοξικής αλληλουχίας 70-95% με την αντίστοιχη του
αγρίου τύπου και σε ορισμένες περιπτώσεις η έκφρασή τους στην P. pastoris οδήγησε στον
σχηματισμό αλλά και την απομόνωση πενταμερών μορίων.
Η σάρωση των μεταλλαγμάτων απέτυχε στην ανεύρεση κάποιας συνθήκης
κρυστάλλωσής τους. Ωστόσο, ο αρχικός έλεγχος συνθηκών κρυστάλλωσης των μονομερών
μορίων της α9wt είχε ως αποτέλεσμα τον προσδιορισμό διαφορετικών συνθηκών όπου
σχηματίζονται πολλαπλοί κρύσταλλοι, τόσο για την γλυκοζυλιωμένη, όσο και την
απογλυκοζυλιωμένη μορφή της. Επιπλέον, η βελτιστοποίηση αυτών των κρυστάλλων στην
περίπτωση της γλυκοπρωτεΐνης, οδήγησε στο σχηματισμό μονοκρυστάλλων, που περιθλούν
ακτίνες-Χ σε ικανοποιητική ανάλυση, καθιστώντας αυτούς τους κρυστάλλους ως
υποσχόμενο υλικό για την επίλυση της δομής της άγριου τύπου α9 ΕΚΠ.
Τέλος, η έκφραση στην κυτταρική σειρά εντόμων Sf9 με το σύστημα των βακιλοϊών
της ολόκληρης α7 υπομονάδας του nAChR και των «κολοβών» διαμεμβρανικών μορφών
της οδήγησε στην ορθή στόχευση των σχηματιζόμενων υποδοχέων στην
κυτταροπλασματική μεμβράνη, ενώ οι φαρμακολογικές τους ιδιότητες προσεγγίζουν αυτές
του φυσικού α7 υποδοχέα. Παρά το γεγονός ότι η έκφραση των κατασκευών αυτών είχε
χαμηλή απόδοση και παρά τις δυσκολίες διαλυτοποίησης και απομόνωσής τους, ανάλυση με
χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, για τουλάχιστον δύο από τα διαμεμβρανικά
μεταλλάγματα, δείχνει ότι οι διαλυτοποιημένες πρωτεΐνες έχουν σχηματίσει έναν πληθυσμό
ολιγομερών της πρωτεΐνης ο οποίος πιθανότατα αντιστοιχεί σε πενταμερή μόρια. Τα
παραπάνω, σε συνδυασμό με την απουσία της εύκαμπτης ενδοκυττάριας περιοχής,
καθιστούν αυτά τα α7 μεταλλάγματα, εφόσον ξεπεραστούν οι δυσκολίες της απόδοσης της
έκφρασης και της απομόνωσης τους, κατάλληλα για λειτουργικές και δομικές μελέτες.
|
|---|
