| Περίληψη: | Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα γενικών καθηκόντων ένζυμο, το οποίο είναι υπεύθυνο για την ενδονουκλεολυτική θραύση των πρόδρομων μεταγράφων tRNA προκειμένου να παραχθούν τα 5΄ ώριμα άκρα τους. Οι περισσότερες μορφές του ένζύμου είναι ριβονουκλεοπρωτεΐνες. Δραστικότητα RNase P έχει απομονωθεί από βακτήρια, αρχαία, ευκαρυωτικά, καθώς και από υποκυτταρικά οργανίδια. Η υπομονάδα RNA των βακτηρίων καθώς και η αντίστοιχη υπομονάδα από ορισμένα αρχαία και ευκαρυωτικά παρουσιάζουν ενζυμική δραστικότητα in vitro, απουσία πρωτεΐνης, σε υψηλές ιοντικές συνθήκες.
Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται για πρώτη φορά η απομόνωση και ο μερικός καθαρισμός και χαρακτηρισμός της ριβονουκλεάσης Ρ από το αιθανολοπαραγωγό βακτήριο Zymomonas mobilis. Το ένζυμο καθαρίστηκε με ανιονανταλλακτική χρωματογραφία, και ο προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας έγινε παρουσία σημασμένου με 32Ρ προδρόμου μεταγραφήματος in vitro μορίου tRNA (ptRNA) του γονιδίου SupS1 του Schizosaccharomyces pombe. Ακολούθησαν πειράματα για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών δράσης του ενζύμου. Πειράματα απενεργοποίησης με μικροκοκκική νουκλεάση και πρωτεΐνάση Κ έδειξαν ότι το ένζυμο για να δράσει απαιτεί την παρουσία πρωτεΐνης και RNA. Μετά από εκτεταμένη ανάλυση in silico εντοπίστηκαν δύο αλληλουχίες μεγέθους 368 nts και 462 nts, οι οποίες παρουσιάζουν ομολογία με την RNA και την πρωτεϊνική υπομονάδα της RNase P από το Escherichia coli αντίστοιχα. Κλωνοποιήθηκε το γονίδιο που κωδικοποιεί την υπομονάδα RNA της RNase P από το Z. mobilis και διαπιστώθηκε ότι είναι ενεργό μέσω πειραμάτων σάρωσης MgCl2. Τέλος μελετήθηκε η επίδραση στο ολοένζυμο αναστολέων της πρωτεϊνικής σύνθεσης όπως η νεομυκίνη, η πουρομυκίνη, η σπιραμυκίνη και το φουσιδικό οξύ, τα οποία επιλέχθηκαν λόγω της ικανότητάς τους να προσδένονται στο RNA.
|
|---|
