| Περίληψη: | Η αποικοδόμηση των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών μέσω του μονοπατιού ουβικιτίνης-πρωτεοσώματος αποτελεί βασική διαδικασία που εξυπηρετεί σημαντικές ομοιοστατικές λειτουργίες του κυττάρου. Η ουβικιτίνη δεσμεύεται ομοιοπολικά στις πρωτεΐνες-στόχους μέσω ενός καταρράκτη ενζυμικών αντιδράσεων, στον οποίο καθοριστικό ρόλο παίζουν τα Ε3 ένζυμα, οι Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης. Η πρωτεΐνη Arkadia είναι μια Ε3 λιγάση με έναν χαρακτηριστικό RING τομέα 69 αμινοξικών καταλοίπων στο C-τελικό άκρο της, μέσω του οποίου ασκεί την δράση της. Εμπλέκεται στο TGF-β σηματοδοτικό μονοπάτι το οποίο ρυθμίζει θετικά, ουβικιτινιλιώνοντας και στοχεύοντας για αποικοδόμηση πρωτεΐνες που αποτελούν αρνητικούς ρυθμιστές του.
Κύριο χαρακτηριστικό του RING τομέα της Arkadia, ο οποίος έχει μελετηθεί και χαρακτηριστεί δομικά μέσω πολυπυρηνικής και πολυδιάστατης NMR φασματοσκοπίας, είναι η δέσμευση δύο ιόντων Zn2+ με χαρακτηριστικό διασταυρώμενο τρόπο (cross brace). Γνωρίζοντας τον πολύ σημαντικό ρόλο του Zn στην δομή και κατ’επέκταση στην δραστικότητα των RING τομέων, πραγματοποιήθηκαν μεταλλάξεις σε δύο αμινοξέα που συμμετέχουν στα μοτίβα δέσμευσης των δύο ιόντων Zn2+, οι H962C και H965C. Το μετάλλαγμα της H962C, στο οποίο εστιάζει η παρούσα εργασία, παρήχθη με βάση τις κλασσικές τεχνικές κλωνοποίησης DNA. Κατάλληλα δείγματα πρωτεΐνης εμπλουτισμένα σε πυρήνες ενεργούς στην φασματοσκοπία NMR, 15N και 13C, προετοιμάστηκαν ώστε να διεξαχθούν τα απαραίτητα πειράματα για τον προσδιορισμό της δομής.
Το σύνολο των NMR φασμάτων απέδειξε ότι πρόκειται για ένα καλά δομημένο και σταθερό πολυπεπτίδιο. Τα δεδομένα από τις μετρήσεις ατομικής απορρόφησης και την επεξεργασία των φασμάτων επιβεβαίωσαν την διατήρηση της δέσμευσης δύο ιόντων Zn2+ ανά πολυπεπτίδιο, όπως στον RING τομέα του φυσικού τύπου της Arkadia. Ταυτόχρονα, πραγματοποιούνται περαιτέρω NMR μελέτες και αναλύσεις των φασμάτων με χρήση των κατάλληλων υπολογιστικών προγραμμάτων για την διερεύνηση της δομής και ικανότητας αλληλεπίδρασης με το Ε2 ένζυμο.
|
|---|
