| Περίληψη: | Η καλσείνη (calcein) γνωστή και με την αγγλική ορολογία Fluorexon/Fluorescein είναι μια μικρού μοριακού βάρους υδατοδιαλυτή ουσία και χρησιμοποιείται ως μόριο- πρότυπο μικρού υδατοδιαλυτού φαρμάκου, σε πλήθος εφαρμογών τόσο στο τομέα της φαρμακευτικής όσο και στο τομέα της χημείας. Η χρησιμότητα της έγκειται στο γεγονός ότι παρουσιάζει φθορισμό που αποσβένειται σε υψηλές συγκεντρώσεις(100mM) και της εύκολης παρακολούθησης της αποδέσμευσης της από σωματιδιακά συστήματα χορήγησης φαρμάκων.
Τα λιποσώματα είναι καθορισμένα λιπιδικά κυστίδια με μέγεθος που κυμαίνεται μεταξύ 0,05-5μm και βρίσκονται εδώ και πολλά χρόνια στο επίκεντρο του ερευνητικού ενδιαφέροντος, ως φορείς φαρμάκων και βιοδραστικών ενώσεων καθώς και για την βελτίωση της απόδοσής τους στους οργανισμούς. Τα λιποσώματα μελετώνται για την απόδοση βιολογικά δραστικών ουσιών κυρίως για τους εξής λόγους:
1. την αδυναμία αυτών των ουσιών να επιτύχουν την επιθυμητή συγκέντρωση στην επιθυμητή περιοχή,
2. την κυτταροτοξικότητά τους και
3. προβλήματα που σχετίζονται με τη χορήγησή τους (για παράδειγμα χαμηλή
διαλυτότητά τους σε κατάλληλο φορέα).
Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι, η μαθηματική μοντελοποίηση και η μελέτη της κινητικής αποδέσμευσης των μορίων της καλσείνης, που λειτουργούν ως μόρια- πρότυπου υδατοδιαλυτού φαρμάκου, σε συστήματα λιποσωμάτων τα οποία παρασκευάστηκαν σε διαφορετικές λιπιδικές συστάσεις με την επίδραση της χοληστερόλης και της πολυαιθυλενογλυκόλης να καθορίζουν τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μορίων της καλσείνης. Ειδικότερα, παρασκευάστηκαν λιποσώματα SUV με την μέθοδο του λεπτού υμενίου, στα οποία εγκλωβίστηκε καλσείνη σε υψηλή συγκέντρωση (100mM) με χρήση ακίδας υπερήχων για περίπου 15 λεπτά, σε συστάσεις (PC, PC/Chol 4:1, 2:1 και 1:1 mole/mole) καθώς και (PC/Chol/PEG 2:1:0.04, 2:1:0.08, 2:1:0.16 και 2:1:0.32 mole/mole/mole). Η μελέτη των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών των συστημάτων αυτών όπως είναι η μέση υδροδυναμική διάμετρος, η πολυδιασπορά και το ζ-δυναμικό τους, πραγματοποιήθηκε με τη χρήση DLS (Dynamic Light Scattering Nano-ZS Malvern UK) στους 25°C. Ο προσδιορισμός της ποσοστιαίας απελευθέρωσης της καλσείνης (% Cumulative calcein release) έγινε μετά από επώαση των δειγμάτων στους 37°C μέσα σε διάστημα 32h, υπολογίζοντας το ποσοστό συγκράτησης της καλσείνης (Latency %) σε καθορισμένα χρονικά διαστήματα με μέτρηση του φθορισμού (FL) της ουσίας. Στη συνέχεια τα αποτελέσματα αποδόθηκαν αναλυτικά σε διαγράμματα LATENCY% και RETENTION% σε συνάρτηση με το χρόνο με σκοπό να δημιουργηθεί ένα ολοκληρωμένο προφίλ για κάθε λιποσωμική δομή. Τέλος κατασκευάστηκαν διαγράμματα RELEASE% σε συνάρτηση με το χρόνο. Όπως αναμενόταν η διπλοστοιβάδα των PEG-λιποσωμάτων είναι πιο σταθερή σε σχέση με την διπλοστοιβάδα των λιποσωμάτων χωρίς PEG με αποτέλεσμα την ελάττωση της διαπερατότητας της λιπιδικής μεμβράνης. Η ίδια υπόθεση έγινε και στην περίπτωση που στα λιποσώματα προστέθηκε χοληστερόλη, όπου η αύξηση της συγκέντρωσης της χοληστερόλης οδήγησε σε αύξηση της ακεραιότητας της διπλοστοιβάδας τους.
Τέλος μια εξίσωση-πρότυπο τριών παραμέτρων κατασκευάστηκε και τροποποιήθηκε κατάλληλα έτσι ώστε να περιγράψει με ακρίβεια τα πειραματικά αποτελέσματα. Οι παράμετροι Kon, Koff περιγράφουν την σύνδεση και την αποσύνδεση των μορίων της καλσείνης από τη λιποσωμική δομή και σε συνδυασμό με την παράμετρο Ks καθορίζουν την απελευθέρωση των μορίων της. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε η συνάρτηση Weibull, μια σαφώς απλούστερη συνάρτηση σε σχέση με την συνάρτηση τριών παραμέτρων που χρησιμοποιήσαμε αρχικά, έτσι ώστε να καθοριστεί ενδελεχώς ο ρόλος της διάχυσης στα συστήματα λιποσωμάτων που παρασκευάσαμε. Επόμενο βήμα ήταν η επεξεργασία των δύο αυτών συναρτήσεων με την τεχνική Monte Carlo, ώστε να εξαχθεί μια εκτίμηση για την τυπική απόκλιση των παραμέτρων των συναρτήσεων.
Τα αποτελέσματα υπέδειξαν την ιδανικότερη τεχνική/μέθοδο προσαρμογής που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για κάθε λιποσωμική δομή που παρασκευάσαμε.
|
|---|
