| Περίληψη: | Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) είναι κατιονικοί δίαυλοι, οι οποίοι ενεργοποιούνται κατόπιν πρόσδεσης κατάλληλου νευροδιαβιβαστή και ευθύνονται για την κυτταρική επικοινωνία δια μέσου της ακετυλοχολίνης. Ο κυριάρχος τύπος νικοτινικών υποδοχέων στον εγκέφαλο των θηλαστικών με υψηλή συγγένεια για νικοτίνη, αποτελείται από α4 και β2 υπομονάδες. Ο συγκεκριμένος τύπος υποδοχέων, είναι υπεύθυνος για την εξάρτηση στην νικοτίνη και θεωρείται ότι εμπλέκεται στις ασθένειες Alzheimer και Parkinson. Για το λόγο αυτό οι συγκεκριμένοι δίαυλοι, αποτελούν έναν σημαντικό στόχο σχεδιασμού και ανάπτυξης φαρμάκων.
Στην προσπάθειά μας να αποκτήσουμε υδρόφιλες περιοχές του ανθρώπινου υποδοχέα α4β2 για δομικές μελέτες ικανές να προσδένουν αγωνιστές, εκφράσαμε τα εξωκυττάρια τμήματα των συγκεκριμένων υπομονάδων στο ευκαρυωτικό σύστημα έκφρασης ζύμης Pichia pastoris. Στα αγρίου τύπου εξωκυττάρια τμήματα αλλά και στις μεταλλαγμένες μορφές τους, στις οποίες έχει αντικατασταθεί η κυστινική θηλιά με την περισσότερο υδρόφιλη αντίστοιχη περιοχή της πρωτεΐνης η οποία δεσμεύει ακετυλοχολίνη, δεν παρατηρήθηκε καμία ειδική αλληλεπίδραση με γνωστούς προσδέτες.
Κρίθηκε λοιπόν αναγκαίο να εκφράσουμε τα εξωκυττάρια τμήματα διασυνδεόμενα με ένα ολιγοπεπτίδιο 24 αμινοξικών καταλοίπων (AGS)8, ως ένα μόριο. Παρατηρήθηκε λοιπόν ότι το συγκαταμερές β2-24-α4-mECD αλλά όχι το α4-24-β2-mECD είναι αρκετά υδατοδιαλυτό μόριο με πολύ καλές ιδιότητες πρόσδεσης αγωνιστών. Η ιωδινιωμένη επιβατιδίνη (125Ι-επιβατιδίνη) και η τριτιωμένη νικοτίνη ([3Η]-νικοτίνη) δεσμεύονται στο συγκαταμερές β2-24-α4-mECD με σταθερές διάσπασης (Kd) 0,38 και 19 nM αντίστοιχα, τιμές οι οποίες προσεγγίζουν τις αντίστοιχες γνωστές από τη βιβλιογραφία, που προσδίδονται σε ολόκληρο τον ανθρώπινο υποδοχέα α4β2. Επιπλέον, το πόσο ειδική είναι η δέσμευση της 125Ι-επιβατιδίνης φαίνεται και από το γεγονός ότι παρεμποδίζεται συναγωνιστικά από τους αγωνιστές νικοτίνη, κυτισίνη, ακετυλοχολίνη και καρβαμυλοχολίνη με τιμές σταθεράς αναστολής (Κi) ίσες με 20,64, 3,24, 242 και 2254 nM αντίστοιχα.
Επιπλέον, επιχειρήθηκε η δημιουργία πενταμερών εξωκυττάριων τμημάτων των ανθρώπινων υπομονάδων α4 και β2. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε συνέκφραση καθενός από τα δύο συγκαταμερή (α4-24-β2-mECD και β2-24-α4-mECD), τα οποία φέρουν χαρακτηριστική αλληλουχία έξι ιστιδινών (6xHis), με κάθε εξωκυττάριο τμήμα των μεταλλαγμένων υπομονάδων α4 ή β2 τα οποία φέρουν την χαρακτηριστική αλληλουχία του οκταπεπτιδίου FLAG. Στις περιπτώσεις της συνέκφρασης του συγκαταμερούς α4-24-β2-mECD με καθένα από τα εξωκυτταρικά και μεταλλαγμένα τμήματα των υπομονάδων α4 ή β2 (α4-mECD ή β2-mECD) δεν παρατηρήθηκε δέσμευση με 125Ι-επιβατιδίνη και συνεπώς δεν προχωρήσαμε σε περαιτέρω χαρακτηρισμό. Μόνο στην περίπτωση της συνέκφρασης του συγκαταμερούς β2-24-α4-mECD με το β2-mECD παρατηρήθηκε πρόσδεση με 125Ι-επιβατιδίνη. Επίσης, οι μελέτες δυναμικής σκέδασης φωτός εμφάνισαν μία εκτεταμένη ετερογένεια μεγέθους των τελικών προϊόντων όπως απομονώνονται μέσω της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης, αποκλείοντας, τουλάχιστον σε αυτό το σημείο οποιαδήποτε προσπάθεια δομικής μελέτης για τα συγκεκριμένα μόρια.
Κατασκευάστηκαν επίσης δύο συγκαταμερή τριμερών (β2-24-β2-24-α4-mECD και β2-24-α4-24-β2-mECD). Δυστυχώς, η ανάλυση μέσω SDS-PAGE και η αποτύπωση κατά Western αποκάλυψε την ύπαρξη ενός μείγματος, το οποίο αποτελείται από ολόκληρα τα μόρια (τριμερή) αλλά και από πολυπεπτίδια στα οποία απουσιάζουν ένα ή και δύο από τα μονομερή εξωκυττάρια τμήματα (διμερή και μονομερή αντίστοιχα). Το συγκεκριμένο αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι το σύστημα ετερόλογης έκφρασης το οποίο χρησιμοποιούμε (P. pastoris) αν και είναι κατάλληλο για την έκφραση των λειτουργικών διμερών συγκαταμερών (β2-24-α4-mECD), είναι μάλλον ακατάλληλο για την έκφραση πιο περίπλοκων κατασκευών, πιθανότατα εξαιτίας γεγονότων ομόλογου ανασυνδιασμού των πλασμιδίων πριν ή κατά την ενσωμάτωσής τους στο γονιδίωμα της ζύμης.
Ακόμα, ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι το απογλυκοζυλιωμένο συγκαταμερές β2-24-α4-mECD εμφανίζει τις ίδιες ιδιότητες πρόσδεσης αγωνιστών. Επιπροσθέτως, το απογλυκοζυλιωμένο συγκαταμερές β2-24-α4-mECD απομονονέται ως μονομερές, γεγονός το οποίο, σε συνδιασμό με την προηγούμενη παρατήρηση, καθιστά την συγκεκριμένη πρωτεΐνη κατάλληλη να χρησιμοποιηθεί σε δομικές μελέτες και πιθανόν για την φαρμακολογική εκτίμηση καινούργιων και ειδικών αγωνιστών για υποδοχείς α4β2.
|
|---|
