| Περίληψη: | Το οξειδωτικό στρες είναι μια κατάσταση στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα όταν σε αυτά η αντιοξειδωτική άμυνα υπερκεράζεται έναντι των οξειδωτικών εκθέσεων των κυττάρων και χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση ελευθέρων ριζών οι οποίες στη συνέχεια προκαλούν καταστροφές στα βιομόρια του κυττάρου (λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες). Το οξειδωτικό στρες φαίνεται να εμπλέκεται στους μηχανισμούς τόσο φυσιολογικών (διαφοροποίηση, γήρανση), όσο και παθολογικών καταστάσεων (νευροεκφυλιστικές παθήσεις). Σε περίπτωση έντονου οξειδωτικού στρες εξαιτίας φυσιολογικών ή παθολογικών ερεθισμάτων στα κύτταρα επέρχονται βλάβες σε μόρια, όπως οι πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου η ακριβής ποσοτικοποίηση της πρωτεϊνικής υπεροξείδωσης με μεθόδους που εξειδικευμένα ποσοτικοποιούν συγκεκριμένες αλλαγές, όπως τη δημιουργία των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων, είναι χρήσιμες για την εκτίμηση της έκτασης της βλάβης.
Οι καρβονυλομάδες υπερισχύουν ποσοτικά ως προϊόντα οξείδωσης των πρωτεϊνών και δημιουργούνται σε συγκεκριμένα αμινοξέα των πρωτεϊνών (λυσίνη, αργινίνη, προλίνη και θρεονίνη [1]) ύστερα από έκθεση των κυττάρων/οργανισμών σε συνθήκες υψηλού οξειδωτικού στρες. Για την ποσοτικοποίησή τους, η κλασική φθορισμομετρική μέθοδος, που στηρίζεται στην αντίδραση των καρβονυλομάδων με το αντιδραστήριο fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTC) παρουσιάζει αρκετά μειονεκτήματα. Τα βασικότερα είναι: (1) η μη φθορισμομετρική διάκριση της προκύπτουσας υδραζόνης από το ελεύθερο FTC, σε συνδυασμό με την απομόνωσή του μέσω πρωτεϊνικής καταβύθισης και αναποτελεσματικού πλυσίματος του πρωτεϊνικού ιζήματος για την απομάκρυνση του μη ειδικά συνδεδεμένου FTC στην πρωτεΐνη, και (2) η υδρόλυση του δεσμού της υδραζόνης σε σύντομο χρονικό διάστημα. Ως εκ τούτου, η κλασική φθορισμομετρική μέθοδος του FTC παρουσιάζει προβλήματα επαναληψιμότητας και ακρίβειας.
H παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή στοχεύει στην ανάπτυξη μιας νέας ευαίσθητης και απλής φθορισμομετρικής μεθοδολογίας με βάση ένα νέο αντιδραστήριο, το Rhodamine B Hydrazine (RBH) για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων σε δείγματα ιστών, η οποία θα αντιμετωπίζει τα προαναφερθέντα μειονεκτήματα της κλασικής φθορισμομετρικής μεθόδου και επιπλέον θα στοχεύει σε μεγαλύτερη ευαισθησία (λιγότερη ποσότητα πρωτεΐνης). Τα αποτελέσματα της διατριβής έχουν ευρεία βιολογική σημασία εξαιτίας του ότι η νέα μέθοδος (φθορισμομετρική RBH μέθοδος) μπορεί να εφαρμοστεί σε ένα μεγάλο εύρος βιολογικών δειγμάτων, κάνοντας τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες έναν αξιόπιστο δείκτη του οξειδωτικού στρες.
|
|---|
