Μελέτη γονιδίων που εμπλέκονται σε μηχανισμούς νευροεκφύλισης στο γενετικό μοντέλο ντοπαμινεργικής απονεύρωσης μυός weaver και σε λεμφοκύτταρα παρκινσονικών ασθενών

• Κύριος συγγραφέας: Σπαθής, Αθανάσιος
• Άλλοι συγγραφείς: Ματσώκης, Νικόλαος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2008
• Θέματα: Νόσος του Πάρκινσον; Μοντέλο weaver; Μικροσυστοιχίες; Νευροεκφύλιση; 616.833; Parkinson's disease; Weaver model; Microarrays; Neurodegeneration

Η νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) είναι η δεύτερη πιο συχνά εμφανιζόμενη νευροεκφυλιστική νόσος του ΚΝΣ και επηρεάζει το 1%-2% του γηράσκοντα πληθυσμού. Η κύρια ιστοπαθολογία της νόσου χαρακτηρίζεται από την προοδευτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών κυττάρων της μέλαινας ουσίας, γεγονός που οδηγεί στην εμφάνιση των πρωτογενών συμπτωμάτων της νόσου τα οποία σχετίζονται με κινητικές δυσλειτουργίες. Τα συμπτώματα της νόσου, στα οποία στηρίζεται η διάγνωσή της, εμφανίζονται αφού ένας σημαντικός αριθμός ντοπαμινεργικών νευρώνων έχει ήδη εκφυλιστεί. Επιπρόσθετα, τα συμπτώματα αυτά δεν είναι ειδικά για τη ΝΠ, θέτοντας τη διάγνωσή της ειδικά στα πρώτα στάδια εκδήλωσής της σχετικά επισφαλή. Η αιτιολογία της νόσου παραμένει άγνωστη έως σήμερα. Η ΝΠ θεωρείται ένα πολυπαραγοντικό σύνδρομο, οι μηχανισμοί παθογένειας της οποίας είναι ακόμα αδιευκρίνιστοι, καθώς τα πρώτα στάδια εξέλιξής της, στα οποία η όποια θεραπεία αναμένεται να είναι πιο αποτελεσματική, δε γίνονται αντιληπτά και κατά συνέπεια δεν μπορούν να μελετηθούν άμεσα στον άνθρωπο. Η παρούσα ερευνητική εργασία είχε 2 σκοπούς: 1) τη μελέτη της παθογένειας της εκφύλισης της μελαινοραβδωτής οδού και 2) την ανίχνευση του παθολογικού φαινοτύπου της ΝΠ σε περιφερειακό ιστό. 1) Στα πλαίσια της πρώτης κατεύθυνσης μελετήθηκε ο μεταλλαγμένος μυς weaver, που αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό γενετικό μοντέλο προοδευτικής εκφύλισης της μελαινοραβδωτής οδού. Ο ιστοπαθολογικός του φαινότυπος στηρίζεται σε μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο girk2 που κωδικοποιεί μια υπομονάδα των GIRK καναλιών. Αν και η μετάλλαξη αυτή βρέθηκε να μη συσχετίζεται με την εμφάνιση της ΝΠ στον άνθρωπο, ανάλογοι υποπληθυσμοί ντοπαμινεργικών κυττάρων εκφυλίζονται και χαρακτηρίζουν την παθολογία του μοντέλου όσο και της νόσου. Σημαντικό πλεονέκτημα του μοντέλου weaver επίσης είναι ότι η έναρξη της νευροεκφυλιστικής διαδικασίας είναι γνωστή και άρα μπορεί να μελετηθεί. Έχοντας ως βάση τα προηγούμενα, κύριος στόχος της ερευνητικής αυτής προσέγγισης ήταν ο προσδιορισμός υποψήφιων γονιδίων που ενέχονται στην έναρξη της ντοπαμινεργικής εκφύλισης στο μοντέλο weaver. Για το σκοπό αυτό εξετάστηκε το μεταγραφικό προφίλ ολόκληρου του γονιδιώματος της ευρύτερης θιγόμενης περιοχής του μεσεγκεφάλου weaver και φυσιολογικών μυών χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώματος μυός. Επιλέχτηκαν μύες 7 ημερών, ηλικίας που βρίσκεται ακριβώς πριν την έναρξη της εκφυλιστικής διαδικασίας. Τα αποτελέσματα που παρήχθησαν περιλαμβάνουν ένα σχετικά μικρό αριθμό γονιδίων που σημειώνουν περιορισμένη αλλά σημαντική αλλαγή των επιπέδων έκφρασης τους στους weaver μύες. Τα γονίδια αυτά διακρίνονται με βάση την λειτουργία τους σε 4 κατηγορίες που αφορούν στη φυσιολογία της σύναψης ή τη νευροδιαβίβαση, τη μεταγωγή σήματος, την ενεργοποίηση της μεταγραφής και τη μεταφορά. Αν και εξετάστηκε η ευρύτερη περιοχή του μεσεγκεφάλου που παράλληλα με τη μέλαινα ουσία περιλαμβάνει και μη θιγόμενες ντοπαμινεργικές ή μη περιοχές και επιφέρει σημαντική αραίωση στα αποτελέσματα των γονιδίων που εμπλέκονται στην εκφύλιση της μελαινοραβδωτής οδού, οι λειτουργίες αυτές έχουν βρεθεί ότι επηρεάζονται στη ΝΠ και στο νευροτοξικό μοντέλο MPTP σε μύες, ακόμα και σε πρώιμα στάδια νευροεκφύλισης. Μάλιστα, είναι η πρώτη φορά που μία τέτοια προσπάθεια προσδιορισμού των μοριακών μηχανισμών παθογένειας του ντοπαμινεργικού θανάτου πραγματοποιείται σε τόσο πρώιμο στάδιο, πριν ουσιαστικά η εκφύλιση αρχίσει να παρατηρείται. Μεταξύ των γονιδίων των οποίων το μεταγραφικό προφίλ βρέθηκε να χαρακτηρίζει ειδικά τη μεσεγκεφαλική περιοχή των μυών weaver, επιλεχτήκαν να πιστοποιηθούν περαιτέρω με QPCR σε μια νέα ομάδα ζώων της ίδιας ηλικίας συγκεκριμένα γονίδια με γνώμονα τη λειτουργία τους και το ποσοστό της αλλαγής των επιπέδων έκφρασής τους στα μεταλλαγμένα ζώα. Τα γονίδια που πιστοποιήθηκαν ότι αλλάζουν το προφίλ της έκφρασής τους στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών περιλαμβάνουν το supt16h, το lasp1, το dlgh4 και ένα καινούργιο μετάγραφο του nurr1. Το supt16h κωδικοποιεί τη μεγάλη υπομονάδα του συμπλόκου FACT, το οποίο είναι σύμπλοκο αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης και παίζει σημαντικό ρόλο στη διεκπεραίωση της μεταγραφικής διαδικασίας. Η μείωση της έκφρασης του supt16h στο μεσεγκέγαλο των μυών weaver είναι πιθανό να σηματοδοτεί ένα γενικότερο μηχανισμό μείωσης της μεταγραφικής δραστηριότητας στην περιοχή. Το nurr1 είναι ένα πρώιμο γονίδιο με καλά χαρακτηρισμένη λειτουργία στην ανάπτυξη και διατήρηση των ντοπαμινεργικών νευρώνων, ενώ μεταλλάξεις του έχουν εμπλακεί στην παθογένεια της ΝΠ. Αλλαγές στο προφίλ έκφρασης του ίσως σηματοδοτούν ένα αντισταθμιστικό μηχανισμό που ενεργοποιείται στη θιγόμενη περιοχή στα πρώιμα στάδια εκφύλισης ή εμπλέκονται στους μοριακούς μηχανισμούς παθογένειας της νευροεκφύλισης. Το lasp1 και το dlgh4 παρατηρήθηκαν να μειώνουν τα επίπεδα της έκφρασής τους στο μοντέλο weaver. Πρόκειται για 2 γονίδια που κωδικοποιούν 2 συναπτικές πρωτεΐνες με πολύ σημαντικό ρόλο στη νευροδιαβίβαση και την απόκριση του μετασυναπτικού νευρώνα. Η μείωση των επιπέδων των πρωτεϊνών αυτών στο μοντέλο weaver μπορεί να οδηγήσει σε δυσλειτουργία της σηματοδότησης στη σύναψη ή της απόκρισης του μετασυναπτικού κυττάρου σε μηχανισμούς που τροποποιούν τη συναπτική φυσιολογία. Επιπρόσθετα, η μείωση των επιπέδων των συναπτικών αυτών πρωτεϊνών θα μπορούσε να επιφέρει αλλαγές στην αρχιτεκτονική της σύναψης, οι οποίες είναι αναμενόμενο να έχουν αντίκτυπο και στο προσυναπτικό άκρο. Συνοψίζοντας, τόσο η μεταβολή της μεταγραφικής δραστηριότητας όσο και η απώλεια ή η διαταραχή της συναπτικής λειτουργίας όπως ανιχνεύονται από τον προσδιορισμό των γονιδίων που διαφοροποιούν το μεταφραφικό τους προφίλ ειδικά στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών, υπαινίσσονται διαδικασίες που ενεργοποιούνται στην ευρύτερη περιοχή πριν η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων αρχίσει να παρατηρείται. Η περαιτέρω ιστολογική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων αυτών στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών, ίσως σηματοδοτεί μια νέα μοριακή κατεύθυνση στη διερεύνηση της έναρξης της εκφυλιστικής διαδικασίας στα ντοπαμινεργικά κύτταρα. 2) Ο δεύτερος σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η προσπάθεια ανίχνευσης του μοριακού αποτυπώματος της ΝΠ σε περιφερειακό ιστό. Προς την κατεύθυνση αυτή χρησιμοποιήθηκαν περιφερειακά λεμφοκύτταρα αίματος επειδή είναι ένας εύκολα προσβάσιμος ιστός, στον οποίο η έκφραση υποδοχέων νευροδιαβιβαστών έχει προταθεί ότι μπορεί να αντικατοπτρίζει την κατάσταση των ομόλογων υποδοχέων του εγκεφάλου, ενώ ειδικά σε σχέση με τη ΝΠ, έχει δειχθεί ότι εκφράζουν φυσιολογικά υποδοχείς ντοπαμίνης οι οποίοι υπερεκφράζονται στη νόσο, ενώ το περιεχόμενο της ντοπαμίνης και η ανοσοαπόκριση της υδροξυλάσης της τυροσίνης μειώνονται στα πρώιμα στάδια της νόσου. Τα στοιχεία αυτά ενισχύουν το ρόλο των λεμφοκυττάρων ως περιφερικό δείκτη της δυσλειτουργίας του ΚΝΣ στη ΝΠ. Για τη μελέτη του μεταγραφικού προφίλ των λεμφοκυττάρων ασθενών της ΝΠ χρησιμοποιήθηκαν πρωτοδιαγνωσμένοι ασθενείς που δεν είχαν λάβει καμία θεραπεία. Πραγματοποιήθηκε υψηλής κλίμακας ανάλυση της γονιδιακής τους έκφρασης με μικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώματος ανθρώπου. Από τη σύγκριση των παρκινσονικών ασθενών με φυσιολογικά άτομα ιδίου φύλου και κατά το δυνατόν αντίστοιχης ηλικίας, η κατηγοριοποίηση όλων των δειγμάτων της έρευνας με βάση το μεταγραφικό προφίλ όλων των γονιδίων τους έδειξε ότι τα παρκινσονικά άτομα διαχωρίζονται μεν, δε διαφέρουν όμως πάρα πολύ από τα φυσιολογικά. Επιπρόσθετα, από την ανάλυση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης σε όλα τα δείγματα προέκυψε ότι η ηλικία, τουλάχιστον οι μεγάλες διακυμάνσεις της, παίζει πιο δραστικό ρόλο στον καθορισμό του μεταγραφικού προφίλ των λεμφοκυττάρων από ότι η νόσος ή το φύλο. Η ομαδοποίηση των δειγμάτων με βάση το πρότυπο της γονιδιακής τους έκφρασης έδειξε ότι τα φυσιολογικά άτομα κατηγοριοποιούνται μαζί σε μία ομάδα παρότι είναι διαφορετικού φύλου. Αντίθετα, το σύνολο των παρκινσονικών ασθενών που χρησιμοποιήθηκαν είναι πιο ετερογενές, γεγονός που υποδεικνύει ότι πέρα από τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών και το στάδιο της νόσου, υπάρχουν άλλοι παράγοντες της νόσου που ρυθμίζουν το μεταγραφικό προφίλ των λεμφοκυττάρων . Λαμβάνοντας υπόψη αυτήν την ποικιλομορφία των παρκινσονικών ασθενών καθώς και το ρόλο της ηλικίας στην εξαγωγή των αποτελεσμάτων, παράλληλα με την κύρια σύγκριση μεταξύ όλων των φυσιολογικών και όλων των παρκινσονικών ατόμων, δοκιμάστηκε μία ακόμη σύγκριση μεταξύ μόνο των παρκινσονικών και υγιών εκείνων ατόμων που πέρα από το χαρακτηρισμό τους διαχωρίζονται μεταξύ τους και από το προφίλ της γονιδιακής τους έκφρασης με βάση τα αποτελέσματα της κατηγοριοποίησης. Τα γονίδια που προέκυψαν από τις συγκρίσεις αυτές να μεταβάλλουν τα επίπεδα έκφρασης τους στα λεμφοκύτταρα των παρκινσονικών ασθενών αφορούν σε λειτουργίες που αντιστοιχούν στη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών και τη μεταγραφή, τη μεταφορά, τη μεταγωγή σήματος και το μεταβολισμό. Οι λειτουργίες αυτές είτε αφορούν σε μηχανισμούς που έχουν βρεθεί να διαταράσσονται στη μέλαινα ουσία της ΝΠ, ή αντιπροσωπεύουν μια περιφερική απόκριση στη νόσο, η παθολογία της οποίας επεκτείνεται έξω από τον εγκέφαλο. Ο προσδιορισμός συγκεκριμένων γονιδίων μεταξύ των αποτελεσμάτων που έχουν ήδη εμπλακεί στη ΝΠ ή παίζουν ρόλο στη φυσιολογία του εγκεφάλου, προσφέρει ένα βιολογικό υπόβαθρο στην προσπάθεια διερεύνησης του μοριακού αποτυπώματος της ΝΠ στα λεμφοκύτταρα.