| Περίληψη: | Η αδειοδότηση της αντιγραφής αποτελεί μία ιδιαίτερα σημαντική διαδικασία, η οποία λαμβάνει χώρα στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής με το σχηματισμό του προ-αντιγραφικού συμπλόκου, που περιλαμβάνει το ORC, το Cdc6, το Cdt1 καθώς και τις MCM 2-7. Η συγκεκριμένη διαδικασία, πραγματοποιείται μία φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο, κατά τη μετάβαση από την M φάση στη G1. Οι παράγοντες που συμμετέχουν υπόκεινται σε εκτεταμένη ρύθμιση προκειμένου να εξασφαλιστεί η απουσία επαναντιγραφής και γονιδιωματικής αστάθειας.
Η πρωτεόλυση μορίων που συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο αποτελεί έναν από τους μηχανισμούς που χρησιμοποιούν τα κύτταρα για τη ρύθμιση των επιπέδων διαφόρων παραγόντων. Το CRL4Cdt2 αποτελεί μία Ε3 λιγάση της ουβικουϊτίνης, η οποία είναι επιφορτισμένη με τη ρύθμιση των επιπέδων του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 κατά την S φάση καθώς και μετά από βλάβες στο γενετικό υλικό. H συγκεκριμένη διαδικασία έχει διαπιστωθεί πως λαμβάνει χώρα σε όλα τα μετάζωα, καθώς και στον σχιζοσακχαρομύκητα. Μεταξύ των υποστρωμάτων του Cdt2 περιλαμβάνονται επίσης το Set8 και το p21.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία, πραγματοποιήθηκε μελέτη των περιοχών της πρωτεΐνης Cdt2 που είναι υπεύθυνες για τη στρατολόγηση της στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης στο γενετικό υλικό. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε καρκινικά κύτταρα MCF7 που υπέστησαν εντοπισμένη βλάβη στο γενετικό υλικό με UV-C ακτινοβόληση και χρήση ειδικών πολυκαρβονικών φίλτρων με μικροπόρους. Για τη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν φορείς που εκφράζουν το αμινο-τελικό (2-417αα) και το καρβοξυ-τελικό (390-730αα) άκρο της πρωτεΐνης, καθώς και ένα μετάλλαγμα ολόκληρης της πρωτεΐνης όπου 6 SQ θέσεις που εντοπίζονται καρβοξυ-τελικά έχουν μεταλλαχθεί σε αλανίνες και δεν μπορούν να φωσφορυλιωθούν από τις ATM/ATR κινάσες. Μετά τη διεξαγωγή των πειραμάτων συσσώρευσης, διαπιστώθηκε πως στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης στρατολογούνται μόνο το Cdt2 6A(SQ) και Cdt2 (390-730). Ωστόσο, η συσσώρευση τους παρουσιάζεται ελαφρώς ασθενέστερη σε σχέση με την πρωτεΐνη αγρίου τύπου. Η συγκεκριμένη παρατήρηση καταδεικνύει πως στην περίπτωση του Cdt2 6A(SQ) η φωσφορυλίωση στις συγκεκριμένες SQ θέσεις είναι σημαντική για τη συσσώρευση της πρωτεΐνης στην περιοχή της βλάβης. Η στρατολόγηση του Cdt2 (390-730) στην περιοχή της βλάβης, συνιστά μία σημαντική παρατήρηση, η οποία υποδεικνύει ότι η πρωτεΐνη Cdt2 διατηρεί την ικανότητα συσσώρευσης στην περιοχή της βλάβης, παρά την απουσία των αλληλουχιών που βρίσκονται στο αμινο-τελικό άκρο και συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση με τα υποστρώματα αλλά και στο σχηματισμό του συμπλόκου της λιγάσης.
Προκειμένου να μελετηθεί η κινητική στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης των μεταλλαγμάτων που παρουσιάζουν συσσώρευση, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της επαναφοράς φθορισμού μετά από φωτολεύκανση (FRAP). Τα αποτελέσματα, κατέδειξαν πως τόσο στα κύτταρα χωρίς βλάβη, αλλά και σε αυτά με εντοπισμένη βλάβη υπάρχει παρόμοια κινητική μεταξύ της πρωτεΐνης αγρίου τύπου και των δύο μεταλλαγμάτων. Έτσι, η ύπαρξη μεταλλάξεων σε 6 SQ θέσεις στην περίπτωση του Cdt2 6A(SQ), αλλά και η απώλεια των αμινοτελικών αλληλουχιών στο Cdt2 (390-730) δεν μεταβάλλουν την κινητική στην περιοχή της βλάβης.
Τέλος, έγινε μελέτη της συμβολής της φωσφορυλίωσης από τις ATM/ATR κινάσες, στη συσσώρευση στην περιοχή της βλάβης. Γι’ αυτό το λόγο έγινε χρήση της καφεΐνης, που αποτελεί αναστολέα των συγκεκριμένων κινασών. Τα αποτελέσματα, κατέδειξαν πως υπάρχει πολύ ασθενέστερη συσσώρευση στη συγκεκριμένη περίπτωση σε σχέση με την πρωτεΐνη αγρίου τύπου και το Cdt2 6A(SQ). Με αυτό τον τρόπο υποδεικνύεται πως η φωσφορυλίωση σε όλες τις SQ θέσεις του μορίου, είναι σημαντική για τη συσσώρευση του στην περιοχή της βλάβης.
|
|---|
