| Περίληψη: | Η πρωτεΐνη Tip60 (Tat-interactive protein, 60 kDa) είναι μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών MYST και αρχικά προσδιορίστηκε ως αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη με την HIV-1 ΤΑΤ πρωτεΐνη. Πολλά από τα μέλη της οικογένειας MYST μεταξύ αυτών και η Tip60, δρουν ως ακετυλοτρανσφεράσες ιστονών, γεγονός που υποδηλώνει πιθανούς ρόλους στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και στην γονιδιακή ρύθμιση. Στη παρούσα διπλωματική, στόχος ήταν η μελέτη του προφίλ έκφρασης της ακετυλοτρανσφεράσης Τip60 σε πληθυσμούς Τ βοηθητικών παρθενικών (CD3+CD4+CD45RA+) και Τ βοηθητικών μνημονικών (CD3+CD4+CD45RO+) λεμφοκυττάρων καθώς και η δράση της στην μεταγραφή του HIV-1 και της IL-2.
Οι λόγοι που μας οδήγησαν στην μελέτη της Τip60 προκύπτουν από πρόσφατα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας, που δείχνουν ότι υπάρχει μια πιθανή αλληλεπίδραση της Tip60 με τον παράγοντα Εts-2, ο οποίος συμμετέχει στη ρύθμιση της μεταγραφής τόσο του γονιδίου της IL-2 όσο και του HIV-1. Επιπλέον η IL-2 και ο HIV-1 παρουσιάζουν κοινή μεταγραφική ρύθμιση που ελέγχεται από την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων σε κοινά cis στοιχεία. Επίσης, η Tip60 είναι μια Τat-αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο Tat του HIV-1. Τέλος το γεγονός ότι ο HIV-1 παραμένει σε λανθάνουσα κατάσταση στα εν ηρεμία Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα καθώς και ότι ο παράγοντας Εts-2, που πιθανόν αλληλεπιδρά με την Tip60, συμμετέχει στη καταστολή της έκφρασης του ιού, υποδηλώνει μια πιθανή συμμετοχή της Tip60 σε αυτή τη διαδικασία.
Αρχικά ελέγξαμε την έκφραση της Tip60 σε υποπληθυσμούς μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs). Η υψηλότερη έκφραση παρατηρήθηκε στα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (CD4+). Για να εξακριβώσουμε το αν και πώς εκφράζεται στους υποπληθυσμούς των Τ λεμφοκυττάρων, απομονώσαμε Τ βοηθητικά μνημονικά λεμφοκύτταρα (CD3+CD4+CD45RO+) από ολικό αίμα ενηλίκων και Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα (CD3+CD4+CD45RA+) από αίμα νεογνών (ομφαλίου λώρου). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι σε συνθήκες μη ενεργοποίησης η Τip60 εκφράζεται περισσότερο στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα (στα οποία η έκφραση του παράγοντα παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητη). Μετά από την ενεργοποίηση των κυττάρων με PMA/IONO (P/I) η έκφραση της Tip60 αυξάνεται σημαντικά στα μνημονικά Th λεμφοκύτταρα ενώ στα παρθενικά Th παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητη. Για να εντοπίσουμε μια λευχαιμική κυτταρική σειρά κατάλληλη για να χρησιμοποιηθεί για πειράματα διαμολύνσεων και ανοσοφθορισμού, ελέγξαμε την έκφραση της Tip60 σε εννέα λευχαιμικές κυτταρικές σειρές και είδαμε ότι η Τ λεμφοκυτταρική λευχαιμική σειρά Jurkat παρουσίαζε την υψηλότερη έκφραση της Τip60.
Η κυτταρική σειρά Jurkat παρουσιάζει επίσης παρόμοιο μοτίβο έκφρασης σε επίπεδο mRNA με τα Τ βοηθητικά παρθενικά λεμφοκύτταρα. Την έκφραση της Tip60 την ελέγξαμε και σε πρωτεϊνικό επίπεδο με τη μέθοδο Western blot σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα που απομονώσαμε από κύτταρα Jurkat. Για να ελέγξουμε τον εντοπισμό της Τip60 στα Jurkat, προχωρήσαμε σε πειράματα ανοσοφθορισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι σε συνθήκες μη ενεργοποίησης (CM) και ύστερα από ενεργοποίηση των κυττάρων (P/I) η Τip60 εντοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων Jurkat. Επίσης η ποσότητα της πρωτεΐνης Τip60 δεν αλλάζει ύστερα από την ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα, αποτέλεσμα που συμφωνεί με τα πειράματα Western blot.
Προκειμένου να ελέγξουμε τη δράση της Τip60 στη μεταγραφική δραστηριότητα του HIV-1 και της IL-2 προχωρήσαμε σε πειράματα διαμόλυνσης Jurkat κυττάρων. Αρχικά διαμολύναμε τα κύτταρα με αυξανόμενες ποσότητες πλασμιδίου υπερέκφρασης της Τip60 (pCMX-tip60) και ελέγξαμε την έκφραση της IL-2 σε μεταγραφικό επίπεδο. Παρατηρήθηκε ότι αυξανομένης της ποσότητας του pCMX-tip60, αυξανόταν και η έκφραση του IL-2 mRNA. Μέσω πειραμάτων CAT-assays σε κύτταρα Jurkat, τα οποία συνδιαμολύναμε με αυξανόμενες ποσότητες πλασμιδίου pCMX-tip60 και πλασμιδίου αναφοράς CAT, που βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του HIV-1-LTR, διαπιστώσαμε ότι η υπερέκφραση της Τip60 αυξάνει και τη μεταγραφική ενεργότητα του υποκινητή του HIV-1.
Προκειμένου να διαπιστώσουμε εάν η Tip60 δρα απευθείας στον υποκινητή του HIV-1 και της IL-2 μέσω της πρόσδεσής της σε αυτόν είτε άμεσα, είτε έμμεσα μέσω συμπλόκου με άλλες πρωτεΐνες, προχωρήσαμε σε πειράματα ανοσοκρατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP assays) του υποκινητή της IL-2. Παράλληλα επειδή δεν υπάρχει γνωστή θέση πρόσδεσης της Tip60 απευθείας στην LTR αλληλουχία του HIV-1 και στον υποκινητή της IL-2 αναζητήσαμε την πρωτεΐνη με την οποία θα μπορούσε να αλληλεπιδρά προκειμένου να προσδεθεί στα παραπάνω. Με πειράματα συνανοσοκατακρήμνισης διαπιστώσαμε ότι υπάρχει αλληλεπίδραση ανάμεσα στην Tip60 και στον παράγοντα Ets-2, ο οποίος προσδένεται άμεσα στην LTR αλληλουχία του HIV-1 και στον υποκινητή της IL-2 και έτσι επαληθεύσαμε τις αρχικές υποθέσεις για την αλληλεπίδραση τους.
Τα πειράματα που πραγματοποιήσαμε μας οδήγησαν στα παρακάτω συμπεράσματα: Υπάρχει διαφορική έκφραση της Tip60 ανάμεσα στα Τ βοηθητικά παρθενικά και μνημονικά λεμφοκύτταρα, αφού σε συνθήκες μη ενεργοποίησης (CM) η έκφραση της Tip60 είναι μεγαλύτερη στα μνημονικά σε σχέση με τα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα. Η ενεργοποίηση των κυττάρων με μιτογόνα προκαλεί επαγωγή της έκφρασης της Tip60 στα μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα, ενώ στα παρθενικά δεν προκαλεί καμία ουσιαστική αλλαγή. Η πρωτεΐνη Tip60 δρα σαν συνενεργοποιητής της μεταγραφής του ιού HIV-1 και της IL-2 μιας και προκαλεί επαγωγή στην μεταγραφική τους δραστηριότητα. Η πρωτεΐνη Tip60 αλληλεπιδρά in vivo με τον παράγοντα Εts-2 και παρουσιάζει το ίδιο πρότυπο πρόσδεσης με αυτόν, στον υποκινητή της IL-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat.
|
|---|
